2.2.1. Mẫu chứng
- Mẫu chứng dương cho phản ứng RT-PCR: ARN đông khô được tách chiết từ chủng vi rút Hanta SEO Gou3 (AB 0275211) do trường Đại học Hokkaido cung cấp. Sau khi hoàn nguyên sử dụng dung dịch TE, ARN chủng chuẩn có nồng độ 107 copies/µl.
- Mẫu chứng âm cho quá trình tách chiết và phản ứng RT-PCR: mẫu phổi chuột nhắt trắng swiss đã được xác định không chứa các tác nhân gây bệnh chủ yếu được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.
2.2.2. Sinh phẩm, hóa chất
- Bộ sinh phẩm tách chiết ARN từ mẫu mô động vật (RNeasy Lipid Tissue Mini Kit - QIAGENE, Đức);
- Bộ sinh phẩm khuếch đại ARN (QIAGEN OneStep RT-PCR Kit - QIAGENE, Đức);
- Thang chuẩnADN (GelPilot MidRange 100bp Ladder – QIAGENE, Đức); - Cặp mồi khuếch đại gen M mã hóa cho protein G2 của vi rút Hanta, SEO-MF (mồi xuôi) và SEO-MR (mồi ngược) đã được tác giả Hua Wang và cộng sự sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền của vi rút Hanta tại Trung Quốc năm 2000 [60], có trình tự nucleotide và sơ đồ mồi như sau:
Bảng 2.1. Trình tự mồi của kỹ thuật RT-PCR phát hiện vi rút Hanta
Tên mồi Trình tự nucleotide (5’ – 3’) Tm
Vị trí gắn trên genome Kích thước sản phẩm đích SEO-MF 1936
(mồi xi) GTGGACTCTTCTTCTCATTATT 49.2
oC 1936 - 1957
418bp SEO-MR 2353
(mồi ngược) TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG 60.6
oC 2331 - 2353
Hình 2.2. Sơ đồ cặp mồi SEO-MF 1936 và SEO-MR 2353 trên đoạn trình tự gen M
2.2.3. Trang thiết bị, dụng cụ
- Máy nghiền Mini-Beadbeater (Mỹ); - Hạt nghiền thủy tinh, đường kính 0,1 mm; - Máy PCR (Applied Biosystems; Mỹ); - Máy chụp kết quả điện di Gel.doc; - Máy định lượng ADN (Nano Drop, Mỹ);
- Máy giải trình tự gen ABI 3100-AvantTM Genetic Analyser (Applied Biosystems; Mỹ) với gel POP-6;
- Các trang thiết bị và dụng cụ cần thiết khác để thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.