* Chuẩn bị
Mật độ tế bào trên đĩa nuôi cấy 70-80%; tế bào đạt yêu cầu cảm quan về mặt hình thái nhƣ hình bầu dục, bám dính tốt, tế bào sáng rõ…;
Các dụng cụ nhƣ ống ly tâm, đầu côn, hộp đựng ống bảo quản tế bào đã đƣợc làm lạnh.…; Ống bảo quản tế bào đƣợc ghi các thông tin: tên tế bào, số lần cấy chuyển, môi trƣờng nuôi cấy, ngày cất.
Môi trƣờng bảo quảntrong nghiên cứu này chúng tôi gồm 50 % FBS + 10% DMSO + 40% DMEM high glucose. Môi trƣờng này c hàm lƣợng DMSO cao hơn so với khuyến cáo của ATCC (5% DMSO). Sau khi pha, môi trƣờng bảo quản đƣợc để ở nhiệt độ khoảng 40C;
Các hóa chất khác: DMEM high glucose (10% FBS, 1% PS), PBS 1X, Trypsin 0,25% - EDTA 1mM đều đƣợc làm ấm ở 370C trong 10-15 phút.
* Các bướcbảo quản tế bào H9C2 (thực hiện lần lượt các thao tác)
Sau khi môi trƣờng cũ đƣợc hút bỏ; Rửa tế bào bằng PBS 1X đã đƣợc làm ấm từ 2- 3 lần nhằm loại bỏ tế bào chết, môi trƣờng cũ, và huyết thanh; Ủ tế bào với Trypsin 0,25% - EDTA 1mM đến khi >90% tế bào tách khỏi bề mặt đĩa;
Tiếp theo đ , mơi trƣờng DMEM có FBS đƣợc bổ sung để ức chế trypsin; Sử dụng pipet trộn nhẹ nhàng. Dịch huyền phù tế bào tạo đƣợc sẽ đƣợc sử dụng với 2 mục đích:
+ Đếm số lƣợng tế bào: hút 20µl huyền phù tế bào vào ống eppendorf 1,5ml, nhuộm tế bào với Trypan Blue để xác định số lƣợng tế bào sống. Bƣớc xác định số lƣợng tế bào sống này là cơ sở góp phần quyết định việc bảo quản và lƣu giữ tế bào thành công cho mục tiêu tiếp theo dƣới đây. Tỷ lệ tế bào sống khi nhuộm Trypan Blue thƣờng phải đạt 80-90% thì mới đƣợc sử dụng để bảo quản.
+ Chuẩn bị mẫu tế bào bảo quản: chuyển phần dịch huyền phù còn lại vào ống ly tâm 15ml và ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, tốc độ 1500 vòng/phút. Sau khi ly tâm, hút bỏ phần dịch phía trên, tái huyền phù khối cặn tế bào với dung dịch bảo quản và chuyển 1,5ml dịch tế bào vào ống bảo quản (thể tích 2ml, đã ghi đầy đủ thông số nhãn).
Sau đ , tiến hành bảo quản ống tế bào ở các điều kiện nhiệt độ: Chuyển ống bảo quản vào hộp đựng và trƣớc khi đƣợc đƣa vào bình lƣu trữ nitơ lỏng, ống bảo quản tế bào mẫu sẽ đƣợc lƣu trữ lần lƣợt ở các nhiệt độ (giảm dần) trong các khoảng thời gian khác nhau nhƣ sau: tủ mát (4-8°C), 1h; tủ lạnh (-30°C), 2h; tủ âm sâu (-80°C), 24h; bình nitơ lỏng, trữ lâu dài.
Khi cần sử dụng tế bào, ống tế bào trữ đơng trong bình nitơ lỏng phải đƣợc hoạt hóa lại và ni cấy theo các quy trình mơ tả ở các mục 3.1.2 và 3.1.3 ở trên.
3.2. Quy trình gây mơ hình TMTTMCM (HR) trên tế bào H9C2
Sau khi thử nghiệm quy trình ni cấy cũng nhƣ đánh giá sự sinh trƣởng của tế bào H9C2, chúng tơi tiến hành thử nghiệm mơ hình bệnh thiếu máu-tái tƣới máu cơ tim. Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng 2 cách để mơ phỏng mơ hình bệnh gồm: (1) sử dụng Cobalt chlorit (CoCl2) và (2) sử dụng buồng thiếu khí oxy (buồng hypoxia).
3.2.1. Mơ hình TMTTMCT sử dụng CoCl2
3.2.1.1. Các bước gây mơ hình TMTTMCT sử dụng CoCl2 trên tế bào H9C2
* Chuẩn bị
Tế bào H9C2 đạt tiêu chuẩn: tế bào khỏe, hình thái rõ ràng, tế bào che phủ khoảng 80% bề mặt nuôi cấy;
Chuẩn bị CoCl2: CoCl2 ở stock 100mM đƣợc pha loãng trong DMEM đến nồng độ cuối cùng là 100µM, 200µM, 300µM và 400µM (0µM là nồng độ đối chứng);
Đĩa 96 giếng trong và các dụng cụ hóa chất cần thiết khác.
Hình 3.7. Các bước gây mơ hình TMTTMCT sử dụng CoCl2 trên tế bào H9C2 trong nghiên cứu
Tế bào H9C2 (đĩa nuôi, mật độ 70 - 80%)
Đĩa 96 giếng, mật độ 5000 và 10000 tế bào/giếng
Xử lý tế bào với CoCl2 ở các nồng độ 100µM, 200µM, 300µM, 400µM
Hút bỏ môi trƣờng chứa CoCl2, rửa bằng PBS, bổ sung DMEM
Xác định khả năng sống của tế bào bằng kit CCK-8
24h
* Các bước thực hiện được mơ tả tuần tự theo tiến trình thời gian như sau:
Sau khi hút bỏ môi trƣờng cũ, tế bào đƣợc rửa bằng PBS 1X từ 2- 3 lần nhằm loại bỏ tế bào chết, môi trƣờng cũ và huyết thanh; uur tế bào với Trypsin 0,25% - EDTA 1mM đến khi khoảng >90% tế bào tách khỏi bề mặt đĩa; bổ sung mơi trƣờng DMEM hồn chỉnh để ức chế Trypsin, trộn nhẹ nhàng; sau đ , số lƣợng tế bào sống đƣợc đếm bằng cách hút 200µl huyền phù tế bào vào ống eppendorf 1,5 ml, nhuộm tế bào với Trypan Blue và soi đếm dƣới kính hiển vi 10x;
Cấy chuyển tế bào vào đĩa 96 giếng trong với 2 mật độ 5000 và 10000 tế bào/giếng; Nuôi tế bào trên ở 370C và 5% CO2, trong 24h; sau 24h nuôi cấy, hút bỏ triệt để môi trƣờng ni cũ, bổ sung thêm vào mỗi giếng 200 µl mơi trƣờng DMEM có chứa CoCl2 ở các dải nồng độ cuối cùng là 0µM, 100µM, 200µM, 300µM, 400µM trong một đĩa 96 giếng, mỗi một nồng độ đƣợc thử lặp lại ở 3 giếng; tiếp tục ủ đĩa tế bào đã chuẩn bị ở 370C và 5% CO2 trong 24h; sau ủ, hút bỏ triệt để môi trƣờng chứa CoCl2, rửa tế bào bằng PBS, bổ sung vào mỗi giếng 100µl mơi trƣờng DMEM mới và ni trong điều kiện bình thƣờng (370C, 5% CO2) trong 24h. Cơng đoạn nuôi/ủ cuối cùng này thực chất là mô phỏng giai đoạn tái tƣới máu/tái cung cấp oxy.
Tại cuối thời điểm thí nghiệm, mỗi giếng tế bào sẽ đƣợc bổ sung thêm 10% thể tích dung dịch CCK-8, nhẹ nhàng trộn đều và ủ đĩa nuôi ở 370C, 5% CO2, 2h. Khả năng sống của tế bào (tỷ lệ tế bào sống ở mỗi dải nồng độ thử nghiệm so với đối chứng) đƣợc xác định gián tiếp qua giá trị OD ở bƣớc sóng 450nm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại ít nhất 3 lần.
3.2.1.2. Kết quả mơ hình TMTTMCT sử dụng CoCl2
Trong thí nghiệm này, ảnh hƣởng của CoCl2 tới khả năng sống của tế bào H9C2 đƣợc ghi lại nhờ việc quan sát thay đổi hình thái và đánh giá tỷ lệ sống của tế bào bằng kít CCK-8.
Các tế bào H9C2 đƣợc nuôi trong môi trƣờng chứa CoCl2 24h để mô phỏng điều kiện thiếu oxy và chúng tiếp tục ni trong mơi trƣờng mới (khơng có CoCl2) 24h tiếp theo để mô phỏng điều kiện tái cung cấp oxy. Kết quả quan sát hình ảnh mẫu (Hình 3.8) cho thấy, khả năng sống của tế bào H9C2 có chiều hƣớng suy giảm,
thể hiện ở số lƣợng các tế bào chết, bóc tách khỏi bề mặt đáy giếng và trôi lơ lửng trong môi trƣờng đĩa nuôi. Hiện tƣợng này đƣợc quan sát rõ và tăng dần khi nồng độ thử CoCl2 tăng từ 100µM đến 400µM. Ở các giếng thử CoCl2 nồng độ 400µM, lƣợng tế bào H9C2 bám dính đáy cịn lại khá ít, lƣợng tế bào chết/bóc tách lơ lửng trong mơi trƣờng ni là nhiều nhất (Hình 3.8.E, chấm/bóng trịn phía trên). Trong khi đ , ở mẫu đối chứng số lƣợng tế bào là nhiều nhất, tế bào phủ đầy bề mặt giếng và hình ảnh tế bào sáng rõ (Hình 3.8.A).
Kết quả phân tích tỷ lệ sống của tế bào H9C2 trong các mẫu thử bằng sử dụng CCK-8 đƣợc thể hiện trong Bảng 3.1 và Hình 3.9 A,B.
Số liệu trong Bảng 3.1, Hình 3.9 cho thấy, tỷ lệ sống của tế bào H9C2 giảm đáng kể và giảm dần khi nồng độ CoCl2 tăng dần từ 100µM tới 400µM. Cụ thể, tỷ lệ sống của nhóm tế bào khi đƣợc bổ sung thêm CoCl2 100µM là 90,24±8,86% (5000 tế bào/giếng) và 89,88±9,73% (10000 tế bào/giếng) so với nh m đối chứng. Tỷ lệ này giảm mạnh xuống c ý nghĩa thống kê ở nh m thử đƣợc bổ sung thêm CoCl2 400µM (37,12±0,17% khi mật độ là 5000 tế bào/giếng và 49,95±2,46% khi mật độ là 10000 tế bào/giếng). Kết quả này có thể là do Co2+ tích tụ vào trong tế bào và thay thế vị trí của ion Fe2+ ở trung tâm và làm bất hoạt enzym hydroxylase [22], do