A)Hộp nhựa Lock&lock; B) Van xe đạp; C) Bình khí hỗn hợp (mũi tên vàng) và dây dẫn khí (mũi tên đỏ); D) Màng lọc vi khuẩn (mũi tên vàng).
- Lắp ráp và hồn thành buồng hypoxia (Hình 3.11).
Hình 3.11. Buồng hypoxia sau khi hồn thành
A) Buồng hypoxia; B) Bình khí hỗn hợp (1- Bình khí; 2- Đồng hồ đo lưu lượng; 3- Dây dẫn khí; 4- Màng lọc).
Để kiểm nghiệm điều kiện và chất lƣợng khí trong buồng khí đã thiết lập, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các điều kiện thay đổi nồng độ khí oxy cung cấp trong q trình ni cấy mẫu tế bào. Đồng thời, các khoảng thời gian khác nhau để xử lý tế bào nuôi trong buồng nuôi cũng đƣợc thử. Ở đây, chamber (nhựa) đƣợc tạo thành có thể sử dụng tối đa đồng thời cho 4 đĩa nuôi cấy 96 giếng.
* Quy trình thử nghiệm buồng thiếu khí oxy trên tế bào H9C2
Các bƣớc chính trong quy trình thử nghiệm buồng hypoxia đƣợc mơ tả trong hình Hình 3.13. Quy trình chi tiết nhƣ sau:
- Chuẩn bị
Tế bào: tế bào H9C2 đƣợc nuôi trong 3 đĩa 96 giếng trong với mật độ 5000 tế bào và 10000 tế bào/giếng ở 370C, 5%CO2 trong khoảng 24h (tính tới thời điểm thử nghiệm mơ hình). Mỗi mật độ tế bào ni sẽ đƣợc lập lại ít nhất 3 giếng. Tỷ lệ tế bào sống ở các đĩa nuôi sẽ đƣợc kiểm tra tại cùng một thời điểm kết thúc thí nghiệm mơ hình. Trong đ :
+1 đĩa tế bào đƣợc dùng làm đối chứng (ĐC), nuôi trong điều kiện thƣờng; +2 đĩa còn lại sẽ đƣợc sử dụng trong quy trình thử nghiệm buồng hypoxia: Một đĩa đƣợc nuôi trong buồng hypoxia 6h và tiếp theo đ là điều kiện thƣờng 36h (HR1); Một đĩa đƣợc nuôi trong buồng hypoxia 10h và tiếp theo đ là điều kiện thƣờng 36h (HR2);
Môi trƣờng nuôi cấy tế bào trong thời gian thiếu oxy (môi trƣờng hypoxia): Để mô phỏng điều kiện của thiếu máu cục bộ, chúng tôi sử dụng môi trƣờng DMEM nồng độ đƣờng thấp (1g/l), không FBS. Môi trƣờng này sẽ đƣợc sục khí hỗn hợp ở trên (95%N2, 5%CO2) trong vòng 3-5 phút trƣớc thời điểm thí nghiệm khoảng 1 ngày để làm giảm lƣợng oxy hịa tan trong mơi trƣờng.
Các nguyên vật liệu: buồng hypoxia (tạo ẩm bằng cách cho đĩa nƣớc tiệt trùng ở đáy), cồn, ….
Tại thời điểm tiến hành thử nghiệm điều kiện thiếu oxy, hút bỏ môi trƣờng cũ, thay bằng môi trƣờng hypoxia, vệ sinh đĩa ni và đặt vào buồng hypoxia.
Xả khí hỗn hợp vào trong buồng với áp lực 10 lít/phút trong vịng 5-10 phút; trong q trình xả khí vào buồng, một đầu của buồng (hộp) sẽ đƣợc mở hé để khí từ trong thốt ra ngồi (mơ phỏng ở Hình 3.12, thay đĩa 96 giếng bằng đĩa nuôi thƣờng), điều này đảm bảo cho lƣợng khơng khí giàu oxy trƣớc đ đƣợc thay thế bằng khí hỗn hợp và làm giảm lƣợng oxy xuống thấp nhất <2%; Sau đ , buồng hypoxia sẽ đƣợc đậy kín, vệ sinh bằng cồn 700 và đặt vào trong tủ nuôi. Thời gian gây điều kiện thiếu oxy cho tế bào H9C2 kéo dài từ 6h đến 10h.
Tại thời điểm tái cung cấp oxy, đĩa nuôi tế bào đƣợc đƣa ra ngồi, mơi trƣờng hypoxia đƣợc thay bằng môi trƣờng DMEM hoàn chỉnh (DMEM high glucose + 10% FBS + 1% P/S). Tế bào tiếp tục đƣợc ni ở điều kiện ni cấy bình thƣờng trong 36h.
Hình 3.12. Các bước sử dụng buồng hypoxia
A) Buồng hypoxia; B) Bình hypoxia chứa đĩa tế bào và đĩa nước cất; C) Kết nối van xả khí ở 1 đầu và 1 đầu còn lại của buồng được để hở ; D) Kết nối van với bình khí
Cuối thời điểm thí nghiệm, mỗi giếng tế bào sẽ đƣợc bổ sung thêm 10% thể tích dung dịch CCK-8, nhẹ nhàng trộn đều và ủ đĩa nuôi ở 370C và 5%CO2 trong khoảng từ 1h đến 4h. Số lƣợng tế bào sống đƣợc xác định gián tiếp qua giá trị OD ở bƣớc sóng 450nm. Thí nghiệm đƣợc lặp lại ít nhất 3 lần. Bƣớc này cũng chính là bƣớc đánh giá hiệu quả thiết lập mơ hình khí đƣợc thực hiện.
3.2.2.2. Kết quả thử nghiệm mơ hình HR sử dụng buồng hypoxia
Sau khi thử nghiệm buồng hypoxia trên tế bào H9C2 theo các bƣớc mô tả ở trên, chúng tôi thu đƣợc kết quả phân tích tỷ lệ tế bào H9C2 sống trong các điều kiện khác nhau về mật độ, thời gian nhƣ mơ tả ở Bảng 3.2, Hình 3.14 và Hình 3.15.
Bảng 3.2. Tỷ lệ tế bào H9C2 sống khi thử nghiệm buồng hypoxia
Mật độ tế bào Nhóm 5000 tế bào (% vs. ĐC) 10000 tế bào (% vs. ĐC) Đối chứng (ĐC) 100 100 HR1 69,25±9,54* 80,05±1,23* HR2 63,13±11,38* 77,87±4,38*
Hình 3.2. Các bước gây mơ hình HR sử dụng buồng hypoxia trên tế bào H9C2
Tế bào H9C2 (đĩa nuôi, mật độ 70 – 80%) Đĩa 96 giếng trong, mật độ 5000, 10000 tế bào/giếng Nuôi ổn định trong 24h Hút bỏ môi trƣờng cũ, thay thế bằng môi trƣờng hypoxia Buồng hypoxia trong 6h, 10h
Tái cung cấp oxy, thay môi trƣờng hypoxia bằng DMEM high glucose, 10%FBS Nuôi ở 370, 5%CO 2 trong 36h Xác định tỷ lệ tế bào sống bằng kit CCK-8
A
B
Hình 3.34. Tỷ lệ tế bào sống khi thử nghiệm buồng hypoxia
HR1: Tế bào được nuôi trong điều kiện thiếu oxy 6h và tái cung cấp oxy 36h; HR2: Tế bào được nuôi trong điều kiện thiếu oxy 10h và tái cung cấp oxy 36h; A)Mật độ 5000 tế bào/giếng; B) Mật độ 10000 tế bào/giếng; mỗi thí nghiệm được
lặp lại ít nhất 3 lần; *(p<0,05) sự khác biệt so với đối chứng ở mỗi mật độ có ý nghĩa thống kê.
Kết quả ở Bảng 3.2 và Hình 3.14 cho thấy, khi thử nghiệm tế bào trong điều kiện hypoxia, tỷ lệ tế bào sống giảm đáng kể so với khi đƣợc nuôi trong điều kiện thƣờng. Đặc biệt, thời gian thiếu oxy càng kéo dài thì tỷ lệ tế bào chết càng tăng. Cụ thể, khi thời gian hypoxia kéo dài khoảng 6h, tỷ lệ tế bào sống là 69,25±9,54% (mật độ 5000 tế bào/giếng) và 80,05±1,23% (mật độ 10000 tế bào/giếng). Khi kéo dài thời gian hypoxia lên 10h, tỷ lệ tế bào sống giảm xuống còn 63,13±11,38% và 77,87±4,38%. Điều thú vị là, kết quả gây chết tế bào trong mơ hình thiết lập ở đây là khá tƣơng đồng với các kết quả nghiên cứu đã công bố sử dụng buồng hypoxia hiện đại (hypoxia incubator) [67, 81],… Điều này cho thấy, buồng hypoxia thiết lập
đƣợc hoạt động khá tốt và quy trình thử nghiệm mơ hình là phù hợp, đảm bảo đủ tiêu chuẩn để thực hiện các thí nghiệm sử dụng mơ hình bệnh lý HR tiếp theo.
Hình 3.45. Tế bào H9C2 ở các điều kiện thiếu oxy/tái cung cấp oxy
A) Tế bào nuôi trong điều kiện thường (đối chứng); B) HR1 (tế bào được nuôi trong điều kiện thiếu oxy 6h và tái cung cấp oxy 36h); C) HR2 (tế bào được nuôi trong điều
kiện thiếu oxy 10h và tái cung cấp oxy 36h).
Hình 3.15 là hình ảnh đại diện tế bào H9C2 trong các đĩa nuôi cấy trong các điều kiện oxy khác nhau. Tƣơng tự với kết quả phân tích CCK-8, các điều kiện gây thiếu oxy 6h và 10h đều có khả năng gây chết tế bào ở mức độ khá tƣơng đƣơng, số lƣợng tế bào chết nhiều (Hình 3.15 B, C), hình thái tế bào khơng cịn rõ nét, nhiều tế bào chết (bóng trắng) trơi lơ lửng trong môi trƣờng đĩa nuôi. Trong khi ở đĩa đối chứng (nhóm tế bào khơng bị gây mơ hình), các tế bào sinh trƣởng tốt, kích thƣớc tế bào đồng đều, to, sáng rõ (Hình 3.15 A). Các cơng bố trƣớc đây đã chỉ ra rằng, thời gian gây hypoxia ngắn có thể làm tăng tỷ lệ sống của tế bào [70] hoặc quá dài có thể gây chết tế bào hoàn tồn [43]. Trong nghiên của chúng tơi, sự tƣơng đồng về kết quả gây mô hình ở các khoảng thời gian 6h, 10h này cho phép nhóm nghiên cứu có thể linh hoạt điều chỉnh thời gian thí nghiệm trong nhƣng điều kiện thực tế khơng cho phép hoặc phù hợp với mục đích ứng dụng để phân tích các thơng số nội bào theo thời gian (trƣớc khi tế bào H9C2 chết). Hơn nữa, mức độ tác động lên tế bào H9C2 là phù hợp với mục đích và định hƣớng chung của nhóm nghiên cứu. Thời gian tới, chúng tôi sẽ khảo sát thêm các điều kiện hypoxia trong khoảng thời gian dài hơn 6h và ngắn hơn 10h.
3.3. Quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2
3.3.1. Quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2
Ty thể chiếm tỷ lệ lớn và là bào quan đặc biệt quan trọng của tế bào cơ tim. Đối với tế bào khỏe mạnh, chức năng chính của ty thể là sản xuất ra ATP thơng qua hệ thống phosphoryl hóa oxy hóa, cung cấp năng lƣợng cho các hoạt động nhƣ co cơ, trao đổi chất, cân bằng ion và chết theo chƣơng trình của tế bào [4]. Tuy nhiên, ty thể cũng là bào quan dễ bị tổn thƣơng bởi nhiều tác nhân trong đáp ứng với các điều kiện stress nhƣ thiếu yếu tố tăng trƣởng, thiếu oxy, stress oxy hóa và tổn thƣơng DNA [28]. Do đ , khi tiến hành nuôi cấy cũng nhƣ đánh giá chất lƣợng tế bào H9C2, bên cạnh các tiêu chí về hình thái, tỷ lệ sống của tế bào, việc đánh giá cấu trúc chức năng ty thể đƣợc coi là một lựa chọn tối ƣu. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu tập trung đánh giá thành phần lipid màng trong ty thể (cardiolipin) và điện thế màng ty thể trong điều kiện thƣờng và trong thử nghiệm mơ hình HR nhằm đánh giá tế bào H9C2 trong các thí nghiệm đặt ra.
Các bước phân tích thành phần lipid màng ty thể và khối lượng ty thể
Mẫu tế bào H9C2 ni cấy bình thƣờng hay trong điều kiện bị gây mơ hình HR nhƣ mô tả ở mục 3.2.1.1 (Các bƣớc gây mơ hình TMTTMCT sử dụng CoCl2 trên tế bào H9C2) và mục 3.2.2.1 (Các bƣớc gây mơ hình TMTTMCT sử dụng buồng hypoxia trên tế bào H9C2) đƣợc sử dụng để phân tích khả năng sống của tế bào hoặc các thông số chức năng ty thể quan tâm.
* Chuẩn bị
Tế bào H9C2 đƣợc nuôi ở các điều kiện thử nghiệm trong đĩa 96 giếng đen, đáy bằng (Corning);
Chất nhuộm huỳnh quang10-N-nonyl acridine orange (NAO 0,1µM, ex/em: 495/519nm, Invitrogen, USA) và Mitotracker Green (MTG 0,1µM, ex/em: 490/516nm);
Máy đọc đĩa 96 và các nguyên vật liệu, dụng cụ khác.
Tế bào đƣợc nuôi ở điều kiện thƣờng hoặc HR nhƣ mô tả ở mục 3.2.1.1 hoặc 3.2.2.1. Tại cuối thời điểm thí nghiệm, các giếng tế bào tiếp tục đƣợc bổ sung thêm chất nhuộm huỳnh quang NAO hoặc MTG với nồng độ sử dụng tƣơng ứng là 0,1µM. Tiếp theo, đĩa ni đƣợc ủ tối thiểu 30 phút trong tối (bọc giấy bạc), ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, giếng tế bào đƣợc rửa 2 lần bằng PBS và bổ sung PBS mới. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở bƣớc sóng chiếu xạ/bƣớc sóng hấp phụ 495/519 nm (NAO) và 490/516 nm (MTG). Giá trị mật độ huỳnh quang đƣợc phân tích, so sánh giữa nhóm thử với nh m đối chứng.
3.3.2. Kết quả thử nghiệm quy trình phân tích ty thể
Từ kết quả tỷ lệ tế bào sống trong mục 3.2.1 và 3.2.2 ở trên, các điều kiện thí nghiệm mơ hình nhƣ: mật độ 5000 tế bào/giếng; điều kiện HR1 thời gian thiếu oxy 6h hoặc CoCl2 200µM đƣợc sử dụng để tiếp tục thực hiện thử nghiệm quy trình phân tích ty thể tế bào H9C2. Trong nghiên cứu này, hai thông số ty thể là mật độ ty thể và thành phần cardiolipin màng ty thể đƣợc lựa chọn để phân tích.
*Thành phần cardiolipin màng ty thể
Sự biến đổi hàm lƣợng cardiolipin của ty thể tế bào H9C2 trong nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thể hiện thông qua sự biến đổi mật độ huỳnh quang NAO nhƣ mơ tả ở Bảng 3.3 và Hình 3.17.
Bảng 3.3. Tỷ lệ mật độ huỳnh quang NAO ty thể tế bào H9C2 khi nuôi ở các điều Hình 3.16. Các bước phân tích ty thể tế bào H9C2
Tế bào H9C2 (đĩa nuôi, mật độ
70 – 80%)
Đĩa 96 giếng đen, mật độ 5000 tế bào/giếng Gây mơ hình TMTTMC T Ủ ở nhiệt độ phòngtừ 30 – 50 phút Bổ sung chất nhuộm huỳnh quang NAO
hoặc Mitotracker Green
Rửa bằng PBS 2 lần
Đo mật độ huỳnh quang NAO (495/519nm); MTG
(490/516nm)
Hình 3.17. Mật độ huỳnh quang NAO của ty thể tế bào H9C2 khi nuôi ở các điều kiện khác nhau.* (p<0,05): sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.
Cardiolipin là phospholipid đặc trƣng của màng trong ty thể và có vai trị thiết yếu đối với nhiều chức năng ty thể nhƣ: hoạt động của chuỗi hô hấp, sự chuyển h a năng lƣợng [21]. Sự suy giảm số lƣợng cũng nhƣ thay đổi cấu trúc cardiolipin dẫn đến sự rối loạn chức năng ty thể và có liên quan mật thiết đến một số lƣợng lớn các bệnh tim mạch nhƣ hội chứng Barth, cao huyết áp và đặc biệt là bệnh thiếu máu cục bộ - tái tƣới máu cơ tim [50].
Theo số liệu trong Bảng 3.3 và Hình 3.17, mật độ huỳnh quang NAO của nhóm tế bào HR1 giảm xuống còn 77,17±4,17% so với nh m đối chứng. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05. Điều này cho thấy, mơ hình HR sử dụng buồng hypoxia thiết kế gây ra sự suy giảm đáng kể lƣợng cardiolipin tại màng trong ty thể dẫn đến giảm lƣợng NAO tích tụ trong ty thể. Sự suy giảm hàm lƣợng cardiolipin sẽ ảnh hƣởng tới chuỗi vận chuyển điện tử I, III, IV, tăng sản sinh gốc tự do oxy hóa (ROS), làm rối loạn hoạt động chức năng ty thể [50], gây chết tế bào.
Kết quả về sự suy giảm hàm lƣợng cardiolipin trong nghiên cứu của chúng tôi tƣơng tự kết quả của Chu. Q và cs (2019) khi thực hiện nuôi tế bào H9C2 ở điều kiện thiếu oxy trong buồng hypoxia hiện đại với 1%O2, 5%CO2, 94%N2 [18]. Bên cạnh đ , tỷ lệ mật độ huỳnh quang NAO thu đƣợc trong mơ hình HR sử dụng buồng hypoxia thiết kế cũng tƣơng đƣơng với kết quả khi gây bệnh bằng CoCl2 200µM
Tỷ lệ mật độ huỳnh quang NAO (% vs. ĐC)
Đối chứng (ĐC) 100 HR1 77,17±4,17* CoCl2 200µM 75,56±10,98*
(với tỷ lệ mật độ huỳnh quang NAO là 75,56±10,98%). Điều này một lần nữa khẳng định hiệu quả hoạt động cũng nhƣ tiềm năng ứng dụng của buồng hypoxia thiết kế trong mơ hình HR. Kết quả nghiên cứu là cơ sở để chúng tôi lựa chọn sử dụng buồng hypoxia đã thiết kế thay cho buồng hypoxia hiện đại trong các nghiên cứu tiếp theo.
* Mật độ ty thể trong tế bào H9C2
Sự thay đổi mật độ ty thể trong tế bào đƣợc xác định thông qua sự thay đổi mật độ huỳnh quang MTG. Mật độ huỳnh quang MTG của tế bào H9C2 nuôi trong
điều kiện thƣờng và điều kiện HR1 đƣợc thể hiện trong Hình 3.18.
Hình 3.18. Mật độ ty thể trong tế bào H9C2 khi nuôi ở các điều kiện khác nhau.
* (p<0.05): sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng.
Hình 3.18 cho thấy, mật độ huỳnh quang của MTG trong nhóm tế bào HR1 giảm đáng kể so với đối chứng. Điều này có thể giải thích là do điều kiện HR đã gây nên rối loạn cấu trúc và chức năng ty thể, làm suy giảm số lƣợng ty thể hoạt động trong tế bào dẫn đến lƣợng MTG tích tụ trong ty thể giảm mạnh. Kết quả này một lần nữa khẳng định buồng hypoxia thiết kế cũng nhƣ quy trình gây mơ hình bệnh thiếu máu cục bộ - tái tƣới máu cơ tim hoạt động hiệu quả trên tế bào H9C2
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi đƣa ra một số kết luận sau:
- Đã thiết lập và đánh giá đƣợc mức độ thành cơng quy trình ni, bảo quản tế bào H9C2:
+ Hoạt h a: Mơi trƣờng hoạt hóa: DMEM high glucose +12% FBS + 1% PS. Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 1500 vòng/phút, trong 5 phút.
+ Cấy chuyển: khi mật độ đạt 80%, tách bằng trypsin 0,25% - EDTA 1mM, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 1500 vịng/phút, 5 phút.
+ Bảo quản: Mơi trƣờng bảo quản: 50% DMEM high glucose + 40% FBS + 10% DMSO.
- Thiết lập và đánh giá đƣợc mức độ thành cơng quy trình gây mơ hình TMTTMCT trên tế bào H9C2:
+ Mơ hình sử dụng CoCl2: mật độ 5000, 10000 tế bào/giếng, thời gian nuôi