Chƣơng 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH SẠCH VÀ LÀM GIÀU AXIT NUCLEIC
1.4.5. Điều kiện và cơ chế phân tử ADN hấp thụ lên bề mặt hạt nano từ bọc silica
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Hình 1.15: Cơng thức cấu tạo của muối Guanidinium thiocyanate
Trong dung môi nƣớc, phân tử muối Guanidinium thiocyanate sẽ phân ly thành cation guanidinium và anion thiocyanate (hình 1.15), cịn hạt silica sẽ bị hydrate hóa (hình 1.6).
Hình 1.16: Cấu trúc bề mặt của silica đã bị hydrate trong dung mơi nƣớc
Hình 1.17: Cation Guanidinium de-hydrate hóa bề mặt silica và thay thế các phân tử nƣớc hình thành liên kết hiđro với bề mặt này
Luận văn thạc sÜ Phạm Thị Trµ
Hình 1.18: Lực tƣơng tác tĩnh điện giữa bề mặt silica tích điện dƣơng với ADN tích điện âm đƣợc hình thành (a) và bị phá vỡ (b)
Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch dựa trên sự tƣơng tác giữ phân tử axit nucleic với bề mặt silica cần tới các điều kiện thí nghiệm đƣợc kiểm soát một cách chặt chẽ nhằm giúp ADN hấp thụ lên bề mặt silica đạt hiệu quả cao. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng ADN có khả năng hấp thụ tốt lên bề mặt silica trong mơi trƣờng có nồng độ muối cao và pH < 7 [7, 20, 38]. Theo nhƣ nghiên cứu của Huijun Tian và cộng sự [20] đã chỉ ra các điều kiện tối ƣu (optimized conditions) cho sự hình thành liên kết giữa ADN và silica đạt hiệu quả cao nhất trong môi trƣờng muối GuSCN hoặc GuHCl 6M và pH bằng hoặc nhỏ hơn giá trị pKa của nhóm silinol của bề mặt silica. Mặc dù vậy, cơ chế liên kết giữa ADN và silica cho tới nay cịn chƣa đƣợc giải thích một cách tƣờng tận, nhƣng giả thuyết đƣợc đông đảo các nhà khoa học ủng hộ đƣợc đƣa ra bởi Huijun Tian và cộng sự. Các nhà khoa học này cho rằng, nồng độ cation Guanidinium cao trong dung dịch làm giảm hoạt động hình thành các ion hydrate của các phân tử nƣớc, qua đó de-hydrate bề mặt silica và thay thế các phân tử nƣớc hình thành liên kết hidro với silica, qua đó làm cho bề mặt silica tích điện dƣơng (hình 1.17). Mặt khác, dƣới sự ảnh hƣởng của các cation Guanidinium ở nồng độ cao, các phân tử ADN
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
điễn giữa điện tích dƣơng của ion muối trên bề mặt silica với điện tích âm của nguyên tử Oxy trong nhóm PO43-
trong bộ khung phân tử ADN (hình 1.18a). Ngƣợc lại, lực hút tĩnh điện này sẽ bị mất đi trong dung dịch có ion muối ở nồng độ thấp và pH>7 bởi khi đó bề mặt silica và ADN sẽ bị hydrate hóa trở lại (hình 1.18b).
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG HẠT NANO TỪ BỌC SILICA TINH SẠCH AXÍT NUCLEIC
Ngày nay, dựa trên nguyên lý của phƣơng pháp Boom nguyên thủy, các hãng hàng đầu về công nghệ sinh học đã không ngừng phát triển và cải tiến phƣơng pháp tinh sạch axít nucleic, đem lại nhiều hiệu quả bất ngờ. Cải tiến đầu tiên là thay vì phải dùng dung dịch các hạt silica, ngƣời ta đã chế tạo các màng lọc xốp silica nhờ vậy mà có thể tách chiết đƣợc axít nucleic bằng cách dùng máy ly tâm hay bơm hút chân không để đẩy dịch tách chiết mẫu bệnh phẩm đi qua màng lọc xốp silica này. Có nhiều hãng đã rất thành công trong sản xuất và thƣơng mại phƣơng pháp dùng màng lọc xốp silica để tách chiết axít nucleic nhƣ Promega, Qiagen, Biorad, GE Health Care, Takara (Nhật Bản) và Bioneer (Hàn Quốc). Một cải tiến khác mang tính đột phá, đó là chế tạo các hạt từ nano bọc silica dùng để tinh sạch axít nucleic từ các mẫu bệnh phẩm. Với cải tiến này, các thao tác tách chiết axít nucleic trở nên đơn giản và nhanh chóng hơn nhiều so với phƣơng pháp nguyên thủy của Boom cũng nhƣ phƣơng pháp dùng màng lọc silica, nhất là khi tiến hành tách chiết trên nhiều mẫu bệnh phẩm. Đặc biệt hơn nữa, chế tạo đƣợc các hạt nano từ bọc silica là một bƣớc nhảy vƣợt bậc giúp cho khâu tách chiết axít nucleic từ các mẫu bệnh phẩm diễn ra một cách tự động bằng máy.
Dựa trên nền tảng kỹ thuật này, công ty Roche Diagnostic đã chế tạo bộ kít chẩn đốn, định lƣợng virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV), virus gây bệnh viêm gan B (HBV), virus gây bệnh viêm gan C (HCV) trong hệ thống kín sử dụng
Luận văn th¹c sÜ Ph¹m Thị Trà
hạt từ bọc silica gọi là Magnapure để tự động hoá đƣợc kỹ thuật tách chiết nucleic axít [36]. Ngồi Roche Diagnostic, Qiagen cũng đƣa ra công nghệ tách chiết axít nucleic bằng máy tự động với tên thƣơng mại BioSprint96, kèm theo các bộ kít sử dụng hạt nano từ bọc silica cho phép tiến hành với 1 - 96 mẫu bệnh phẩm trên đĩa ELISA [39]. Hãng Beckman Coulter cũng có hệ thống tự động tinh sạch axít nucleic với tên thƣơng mại Beckman Coulter Biomek® 2000 và hãng Promega chế
một dụng cụ có tên thƣơng mại MagnaBot96 có thể hút hạt từ trong đĩa ELISA thao tác bằng tay trên nhiều mẫu một lúc [40]. Hãng Invitrogen cũng sử dụng công nghệ hạt nano từ bọc silica để chế tạo các bộ kít tách chiết nucleic axít nhƣng chỉ hạn chế trong phạm vi nghiên cứu [41, 42].
Tuy nhiên giá thành của các bộ kít tinh sạch axít nucleic bằng hạt nano từ bọc silica nhập khẩu rất cao, ví dụ ở Việt Nam 5 ml hạt từ Dynabeads Myone SILANE® của hãng Invitrogen đƣợc bán với giá khoảng 9 triệu đồng, kít tinh sạch
plasmid Wizard® MagneSil® Plasmid Purification System của hãng Promega có giá
khoảng 7 triệu đồng. Bộ kít tách chiết axit nucleic và phát hiện HIV của hãng Roche Diagnostic có giá là 53 triệu đồng cho 48 phản ứng. Ngoài HIV, HBV và HCV, hiện nay chƣa thấy có bộ kít thƣơng mại nào chẩn đoán các tác nhân gây bệnh khác ví dụ nhƣ EBV, vi khuẩn lao,…, sử dụng phƣơng pháp tách chiết bằng hạt nano từ bọc silica.
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà