Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP
2.2.6. Định lƣợng gen đích bằng kỹ thuật PCR tại thời điểm (Real-time PCR)
Nguyên tắc: Giống nhƣ kỹ thuật PCR thông thƣờng, kỹ thuật Real time-PCR cũng dựa trên khả năng nhân bản một trình tự ADN đích khi có mặt cặp mồi đặc hiệu của enzyme ADN polymerase. Tuy nhiên, khác với kỹ thuật PCR thông thƣờng, Real time-PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sự tích lũy các sản phẩm khuyếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra do trong hỗn hợp phản ứng có bổ sung thêm chất phát
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
quang (SYBR Green) hay bị phân hủy do hoạt tính 5’-3’ exonulease của Taq polymerase trong quá trình kéo dài chuỗi (Taqman probe) và đƣợc bộ phận phát hiện huỳnh quang của máy Real- PCR thu nhận. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh lƣợng sản phẩm khuyếch đại trong mỗi chu kỳ. Chính vì vậy, kỹ thuật Real-time PCR có độ chính xác và độ nhạy rất cao, tiết kiệm thời gian. Hơn nữa, kỹ thuật này còn giúp giảm nguy cơ ngoại nhiễm và các thao tác sau phản ứng khuyếch đại.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật Real-time PCR đƣợc sử dụng để đánh giá khả năng tách chiết ADN EBV của bộ kít Virus Magnet Nano Kit với hai bộ kít
thƣơng mại MinElute® Virus Spin Kit của hãng Qiagen và Dynabeads Myone
SILANE® của hãng Invitrogen thể hiện bằng số copies ADN EBV trong các mẫu
máu mà các bộ kít này tách đƣợc. Chất phát huỳnh quang đƣợc sử dụng trong phản ứng là Taqman probe đặc hiệu cho đoạn gen đích EBV có kích thƣớc 74 bp (ký hiệu là EBV-74), sự phân giải của probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’ của probe và phát tín hiệu huỳnh quang, tín hiệu này sẽ đƣợc ghi nhận bởi đầu đọc real-time của máy. Kết quả đƣợc phân tích bằng phần mềm IQ5 Optical System (Bio - Rad).
Thành phần của phản ứng Real-time PCR Thể tích
- Master Mix Roche (2x) 10 µl
- Mồi EBV Fw3 xuôi (10 pmol) 0.75 µl
- Mồi EBV Rv3 ngƣợc (10 pmol) 0.75 µl
- Taq man probe (5pmol) 0.5 µl
- H20 3 µl
- Khn ADN EBV 5 µl
Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Chu kỳ nhiệt
45 chu kỳ
Giai đoạn biến tính 950C – 15 giây
Giai đoạn gắn mồi và kéo dài 600C – 1 phút