Tiến trình thực hiện:
- Để xác định được hoạt tính enzyme phân hủy lignin của các chủng nấm mốc, tiến hàng cấy một ống giống thạch nghiêng của mỗi chủng vào môi trường Czapek dịch thể thành phần như sau: Glucose : 10 g; Pepton : 5 g; Na2HPO4 : 2,4 g; K2HPO4 : 2 g; NH4NO3 : 0,1 g; MgSO4 : 0,01 g; CaCl2 : 0,01 g; Nước cất : 1 L
Bổ sung cơ chất là Lignin : 1 g.
N1 )
N2 N3 N4 N5
- Sau khi cấy trực tiếp các chủng trên môi trường thạch đĩa, nuôi lắc 120 vòng/phút trong vòng 6 - 7 ngày, đặt các đĩa đã cấy vào tủ ấm và giữ ở 30°C. Thu 10 mL dịch nổi, ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
- Tiến hành đánh giá khả năng phân huỷ lignin với phản ứng chứa tổng thể tích là 2 mL, trong đó:
+ 300 µL dung dịch 6,6 mM DMAB + 100 µL dung dịch 1,4 mM MBTH + 30 µL dung dịch 20 mM MnSO4 + 1560 µL dịch nổi vừa lọc ở trên + 10 µL dung dịch 10 mM H2O2
Phản ứng màu được đo ở bước sóng 590 nm trên máy đo quang phổ với cuvet có đường kính 1 cm. Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme mà oxy hóa được 1 µmol cơ chất trong 1 phút. Như vậy trong trường hợp này, cơng thức tính sẽ là:
Hoạt độ enzyme (đơn vị/ml) = (ΔAbs/phút) x (0,002/0,053) x số ml mẫu. Trong đó:
+ ΔAbs: sự thay đổi về độ hấp thụ theo thời gian (phút) + 0,053: hệ số hấp thụ mol của cơ chất tại bước sóng 590 nm + ε = 0,053 µM-1cm-1
Sau đó dựa vào hoạt độ enzyme phân hủy lignin của các chủng nấm mốc đã nuôi cấy để tuyển chọn được chủng nấm có hoạt tính cao nhất. Chủng nấm mốc được tuyển chọn sau đấy sẽ được bổ sung vào Biomix để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3. Phương pháp chuẩn bị các Biomix
Biomix được chuẩn bị dựa theo phương pháp của Fernández-Albertil và cs. (2012) với một số cải tiến như thay than bùn bằng bã thải trồng nấm và bổ sung chủng nấm mốc phân huỷ lignin vào Biomix [16].
2.2.3.1. Chuẩn bị các Biomix
a) b)
c) d) e)