Nhóm hợp chất clo hữu cơ rất đa dạng về thành phần và cấu tạo hợp chất. Trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu, chúng tơi xin đi sâu tìm hiểu đối với 3 hợp chất sau đây.
1.6.1 Hợp chất 1,2 - Dichloroethane (1,2 - DCE)
Hợp chất hóa học 1,2-dichloroethan (hoặc 1,2 - DCE ) được tạo ra lần đầu tiên năm 1974 từ khí olefin và khí clo, là một hydrocacbon clo, có cơng thức hóa học là C2H4Cl2 được sử dụng chủ yếu để sản xuất vinyl clorua monomer (VCM, chloroethene) là các tiền thân sản xuất nhựa PVC. 1,2 - DCE là chất lỏng khơng màu, có mùi giống chloroform. Ngồi ra, nó được sử dụng như một trung gian cho các hợp chất hóa học hữu cơ khác và như một dung mơi [21].
Hình 3. Cơng thức hóa học của 1,2-DCE
1,2 - DCE là chất độc (đặc biệt khi hít phải do độ bay hơi cao), rất dễ cháy và là hợp chất gây ung thư [14,41]. Trong các sản phẩm bằng nhựa như đồ chơi cho trẻ em đã phát hiện ra việc giải phóng DCE trong nhà với liều lượng đủ cao để gây ung
thư. Hơn nữa, DCE có tính tan rất thấp trong nước và hầu như không thể phân hủy tự nhiên trong môi trường, chu kì bán phân rã của hợp chất này đến 50 năm trong các tầng ngậm nước khiến chúng trở thành chất gây ô nhiễm lâu dài đồng thời gây nguy hiểm đến sức khỏe con người và sinh vật [61].
1, 2 - dichloroethan được sản xuất chủ yếu thông qua xúc tác phản ứng của ethene (etylen) và clo được xúc tác bởi sắt (III) clorua:
H 2C = CH2 + Cl2 → ClCH2 - CH2 Cl (1,2-dichloroethan)
1,2-dichloroethan cũng được tạo ra bởi phản ứng oxy clo hóa etylen được xúc tác bởi đồng (II) clorua:
2 H2C = CH2 + 4HCl + O2 → 2ClCH 2 - CH2Cl2 + H 2O
Với khoảng 80% lượng tiêu thụ 1,2-dichloroethan trên thế giới, thì 1,2- dichloroethan được sử dụng chính trong sản xuất vinyl cloruamonomer (VCM, chloroethene) đồng thời tạo ra HCl sau phản ứng như một sản phẩm phụ. VCM là đơn phân của polyvinyl clorua (PVC). Hydro clorua có thể được tái sử dụng trong việc sản xuất 1,2-dichloroethan qua con đường oxy clo hóa [21].
Cl-CH2 -CH 2 -Cl → H2C = CH-Cl + HCl
Vì là dung mơi aprotic phân cực tốt, 1,2-dichloroethan có thể được sử dụng như chất tẩy nhờn và tẩy sơn. Nó được sử dụng như một trung gian trong việc sản xuất các hợp chất hữu cơ khác nhau như ethylenediamine. Trong phịng thí nghiệm được sử dụng như một nguồn clo khi loại bỏ ethene và clorua. Thông qua một số phản ứng 1,2-dichloroethan tạo ra 1,1,1-trichloroethane, đây là chất được sử dụng trong giặt khô. Trong lịch sử, 1,2-dichloroethan đã được sử dụng như một chất phụ gia chống kích nổ trong nhiên liệu pha chì [25].
1.6.2. Hợp chất 2,2-Dichloropropionate Sodium (2,2-DCPS)
Cịn có tên là Dalapon, có cơng thức hóa học là C3H3Cl2NaO2. Dalopon là dạng muối hóa học của 2,2-Dichloropropionic (2,2-DCP) có 3 cacbon với 2 nguyên tử Clo gắn ở vị trí α-C. Đây là loại thuốc trừ cỏ được sử dụng sau khi hạt nảy mầm và có độ độc trung bình đối với người. Dalapon có dạng bột, rất dễ hịa tan trong
nước và dung mơi hữu cơ, do đó việc sử dụng rộng rãi Dalapon gây ra sự xâm nhập lớn loại thuốc trừ cỏ này vào nguồn nước, dẫn đến ơ nhiễm mơi trường.
Hình 4. Cơng thức hóa học của 2,2-DCPS
Hợp chất 2,2-DCPS thủy phân chậm trong nước tạo ra pyruvic acid và Cl-. Khả năng phân hủy càng tăng khi tăng nhiệt độ và nhanh hơn trong môi trường kiềm. Dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời, sự phân hủy 2,2-DCP cũng xảy ra chậm tạo thành pyruvate sau đó chuyển hóa thành cacbondioxide và acetandehyde [28].
Ở Việt Nam, 2,2 DCPS thường được dùng để trừ cỏ một lá mầm và hai lá mầm kể cả lau sậy, cỏ tranh hay các loại cỏ có bộ rễ ăn sâu dưới đất. Thuốc có tác dụng nội hấp nên hấp thu vào lá cỏ rất nhanh, cũng có thể xâm nhập qua rễ cỏ, làm rối loạn sinh lý nên lá biến dạng, thân cong queo, giòn, dễ gẫy và cuối cùng bị chết [54]. Hàm lượng 2,2-DCP với mức vượt quá 2660 ppm trong môi trường đất sẽ gây ức chế, kìm hãm các vi sinh vật đồng hóa ni tơ trong đất. Với nồng độ lớn gây ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng hoa màu, lương thực [32].
2,2-Dichloropropionate Sodium còn ảnh hưởng tới sức khỏe con người. Khi tiếp xúc với nồng độ cao và trong thời gian dài có các triệu chứng như dị ứng da, bỏng da, có hại cho mắt, hệ hô hấp, mệt mỏi, chán ăn, tiêu chảy, nôn mửa, làm chậm xung thần kinh trung ương, có thể gây trầm cảm [72].
1.6.3. Hợp chất 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA)
Hợp chất 3,4-Dichloroaniline có cơng thức hóa học là C6H5Cl2N. Dạng chất rắn màu nâu, khơng tan trong nước, khơng tương thích với các tác nhân oxy hóa, các axit, axit clorua và anhydit axit, rất dễ cháy [77].
3,4-DCA được sử dụng như một trung gian trong cơng nghiệp hóa chất để tổng hợp 3,4-dichlorophenylisocyanate, các thuốc diệt cỏ propanil và thuốc nhuộm azo cho vải polyester. Thực tế không sử dụng được trực tiếp 3,4-DCA mà khơng biến đổi hóa học. 3,4-dichlorophenylisocyanate được đưa ra thị trường và tiếp tục sử dụng để sản xuất thuốc diệt cỏ phenylurea (diuron, linuron) và chất diệt khuẩn trichlorocarbanilide 3,4-DCA giải phóng vào thủy quyển thơng qua nước thải trong q trình sản xuất. Nó cũng được thải vào mơi trường trong suốt q trình sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ 3,4-DCA như linuron, diuron, propanil. Thêm nữa, 3,4-DCA được giải phóng như một tạp chất của các thuốc BVTV này nên phần lớn chúng tồn dư trong đất nông nghiệp [43]. Khi tiếp xúc với 3,4- DCA nồng độ cao, người bị ngộ độc cấp tính do hình thành methaemoglobin gây tím tái, mệt mỏi, khó thở đồng thời làm rối loạn hệ thần kinh và gây tê liệt [24].
Trước đây 3,4-DCA được coi là khơng có khả năng phân hủy trên bề mặt nước thải. Tuy nhiên, thí nghiệm phân hủy với mẫu trầm tích thích hợp, 3,4-DCA đã bị phân hủy 82% sau 28 ngày [17]. Thí nghiệm phân hủy ở tầng giữa cho thấy 3,4-DCA phân hủy 45% sau 30 ngày. Nghiên cứu sự phân hủy 3,4-DCA trong đất chỉ ra tỷ lệ khoáng giảm theo nồng độ ngày càng tăng của 3,4-DCA… [49]. Trong khơng khí, chu kỳ bán rã của 3,4-DCA là 9 giờ xảy ra nhờ q trình quang hóa với các gốc OH. Sự phân hủy sinh học hợp chất 3,4-DCA xảy ra nhờ một số vi sinh vật như Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter hay Myroides odoratimimus…[58,66,
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ các chủng vi khuẩn phân lập từ các mẫu đất, mẫu nước thu thập tại xã Sơn Đồng, huyện Hoài Đức, Hà Nội. Đây là nơi có sử dụng thường xuyên thuốc bảo vệ thực vật trong việc trồng hoa.
Các mẫu sau khi thu thập được bảo quản lạnh và chuyển về phịng thí nghiệm phân tích trong thời gian 24 giờ.
2.2. Hóa chất – Dụng cụ 2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy 2.2.1. Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trường chọn lọc MGB (1 lít) [37].
100 ml BS 10x (BS là dung dịch muối khoáng cơ bản)
100 ml TMSS 10x (TMSS là dung dịch muối của các kim loại) 800 ml H2O
Dung dịch Basal Salts (BS) 10x/ 1 lít
K2HPO4.3H2O 42.5g (NH4)2 SO4 20g NaH2PO4.3H2 O 10g
Dung dịch Trace Metals Salts Solution (TMSS) 10/ 1 lít
MgSO4.7H2 O 2g FeSO4.7H2 O 120mg MnSO4.4H2 O 23mg ZnSO4.1H2 O 18mg CoCl2.6H2 O 10mg EDTA 0,5M pH=7,5 Môi trường Luria Bertani (LB)
Cao nấm men 5g NaCl 10g Nước cất 1 lit
2.2.2. Hóa chất..
- 1,2-Dichloroethane (1,2-DCE) được mua từ hãng Prolabo (Mỹ). - Sodium-2,2-Dichloropropionate (2,2-DCP) từ hãng Meck (Đức). - 3,4-Dichloroaniline (3,4-DCA) của Sigma (Mỹ).
Môi trường BS, LB được khử trùng ở 121C trong thời gian 120 phút. Môi trường TMSS và các hóa chất 2,2-DCP, 3,4-DCA sau khi hòa tan được lọc bằng màng lọc vô khuẩn với kích thước lỗ 0,2m.
Các hóa chất khác trong sử dụng đều có độ tinh sạch cao đảm bảo cho các nghiên cứu phân tích.
2.3. Máy móc, thiết bị
Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu gồm: Nồi khử trùng (ALP - Nhật); Máy lắc (Satorius - Đức), Wibecuse (Hàn Quốc); Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý); Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh); Cân Kern (Satorius - Đức); Cân Pressica XT 220A (Ý); Tủ ấm (Memmert - Đức); Máy li tâm sigma 3K30 (Sartorius - Đức); Vortex (Ika - Đức); Tủ sấy (Memmert - Đức); Máy khuấy từ (Ika - Đức); Kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại Bộ môn Vật lý, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phƣơng pháp thu mẫu.
Mẫu đất và mẫu nước tại khu vực vườn hoa xã Sơn Đồng, huyện Hoài Đức, Hà Nội được thu vào các Falcon bằng các dụng cụ đã khử trùng và đạt quy chuẩn về độ sạch.
Mẫu đất được lấy bề mặt đất và ở độ sâu 5 cm so với bề mặt. Mẫu nước thu ở khu vực nước đọng; cống thoát nước và mương nước.
Phƣơng pháp nuôi cấy làm giàu
Các mẫu nuôi cấy được làm làm giàu 2 lần, 5 ngày/lần trong môi trường chọn lọc (môi trường MGB) bao gồm các thành phần mơi trường khống cơ bản BS, môi trường các nguyên tố vi lượng TMSS và cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4- DCA với nồng độ lần lượt là 5mM, 20mM, 50mg/l tương ứng [37]. Môi trường được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút trước khi bổ sung cơ chất mỗi bình 1g mẫu đất, 3ml mẫu nước. Các bình có chứa mẫu được ni cấy lắc trong 5 ngày ở 30C, 160rpm. Sau 5 ngày mẫu được chuyển sang nuôi trên môi trường MGB sạch để làm giàu lần thứ 2. Trong q trình ni cấy, phân lập ln đậy chặt nắp bình để tránh sự bay hơi của cơ chất [36, 61].
Phƣơng pháp cấy gạt
- Môi trường thạch MGB bao gồm các thành phần dung dịch BS 10x, TMSS 10x, thạch agar 20g/l, EDTA 0,5M và bổ sung cơ chất khác nhau là 1,2- DCE nồng độ 5mM, 2,2-DCP nồng độ 20mM và cơ chất 3,4-DCA nồng độ 50mg/l được đổ vào các đĩa petri thủy tinh sạch.
- Lấy 100 µl dịch ni cấy đưa vào ống eppendorf chứa 900 µl nước cất đã được khử trùng để được độ pha lỗng 10-1. Vontex đều sau đó lấy 100 µl dung dịch ở độ pha lỗng 10-1 cho vào ống eppendorf chứa 900 µl nước cất vơ trùng để được độ pha loãng 10-2 . Tiếp tục như vậy đến nồng độ 10-6.
- Lấy 100µl dung dịch pha lỗng mẫu ở các nồng độ thích hợp, dùng que gạt trải đều lên đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy cho đến khi bề mặt thạch khô.
2.4.3. Phƣơng pháp bảo quản giống
Tinh sạch, ria cấy 3 pha các chủng để thu nhận chủng thuần khiết, sau đó giữ giống trong ống nghiệm môi trường thạch nghiêng.
Vi khuẩn được nuôi trong ống thạch nghiêng thạch LB, ni ở nhiệt độ phịng. Sau khoảng 2-3 ngày khi vi khuẩn đã mọc tốt cất vào tủ mát ở nhiệt độ 4-6oC. Sau 1-2 tháng cấy truyền lại một lần.
Nhằm bảo quản được giống lâu hơn, để giống trong paraffin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2 năm.
2.4.4. Phƣơng pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất clo
Mơi trường chọn lọc có bổ sung thạch và bromothymol blue (75mg/l) [27]. Khả năng phát triển và tạo màu trên mơi trường có bromothymol blue nhằm chọn lọc các chủng có khả năng phân giải tốt cơ chất do Bromothymol blue là chất chỉ thị màu cho khả năng phân giải hợp chất clo.
Có thể dễ dàng nhận ra sự phân giải cơ chất của các chủng vi sinh vật khi enzyme dehalogenase của vi sinh vật xúc tác phản ứng cắt đứt liên kết C-Cl, giải phóng HCl làm thay đổi pH mơi trường, điều đó khiến cho bromothymol blue trong môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu vàng [64]. Các chủng có sự chuyển màu rõ rệt nhất và có khả năng sinh trưởng mạnh nhất sau 3 ngày sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.4.5. Phƣơng pháp phân loại các chủng nghiên cứu Phƣơng pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc
Dựa vào sự khác biê ̣t giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thốt của tinh thể tím [1].
Phương pháp tiến hành
- Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nước cất lên lam kính. Dùng que cấy vơ trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn (sau khi cấy 24h) hòa đều vào giọt nước và giàn thành lớp mỏng. Sau đó, cố định vết bơi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm tiêu bản bằng tím kết tinh trong vịng 1 phút. - Nhuộm bổ sung lugol trong 30 giây.
- Tẩy cồn.
- Rửa nước, hong khô.
- Nhuộn tiếp bằng Safranin trong 20s, rửa nước, làm khơ. - Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100X.
Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ hồng.
Chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa thạch LB không quá 24 giờ ở 37C.
- Gắn mẫu vi khuẩn lên lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu. - Gắn mẫu lên đế mạ phủ mẫu vàng trên máy JFC-1200 trong 5 phút ở 30mA. - Soi và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại
phòng Chụp hiển vi điện tử quét - Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu - Khoa Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
Giải trình tự gen 16S ARNr
- Mẫu vi sinh vật được gửi đến công ty Macrogen - Hàn Quốc để tiến hành giải trình tự gen 16S ARNr.
- Kết quả phân tích trình tự được so sánh với các loài trong ngân hàng gen quốc tế bằng phương pháp Clustal X.
- Sau đó xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm Tree phylogenetic.
2.4.6. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý sinh hóa của các chủng nghiên cứu
Để kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ điển hình của các chủng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành thử với Kit thử API 20NE cho vi khuẩn Gram (-) và Kit thử API 50CHB cho vi khuẩn (+) của hãng BioMérieus. Hóa chất và thuốc thử được cung cấp cùng với bộ kit tương ứng.
Các bước tiến hành được tóm tắt như sau:
Tiến hành với Kit API 20NE
- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn mới nuôi, không quá 24 giờ
- Sau khi nuôi cấy tiến hành bổ sung vi khuẩn vào nước cất khử trùng sao cho OD600nm đạt giá trị 0,132.
- Bổ sung 0,2ml dịch vi khuẩn đã pha loãng vào các giếng từ NO3 đến PNPG, bổ sung thêm dầu khống vào các ống kí hiệu GLU, ADH, URE.
- Thêm 0,2ml dịch vào các ống API AUX, trộn nhẹ cho đều, rồi bổ sung 0,2ml dịch này vào các ống còn lại từ GLU đến PAC.
- Sau 24h kiểm tra NO3- bằng thuốc thử NIT 1 và NIT 2, nếu phản ứng dương tính, sau 5 phút dịch trong ống sẽ chuyển thành màu hồng đỏ, nếu âm tính sẽ khơng có màu. Nếu phản ứng âm tính thì cần kiểm tra việc sản xuất nito bằng cách bổ sung thêm 2-3mg Zn2+. Sau 5 phút nếu dịch trong ống khơng màu thì là phản ứng dương tính, nếu chuyển sang màu hồng là âm tính. - Kiểm tra TRP bằng cách thêm 1 giọt thuốc thử JAMES, phản ứng dương tính
sẽ cho màu hồng ngay tức khắc; ESC kết quả dương tính cho màu đen, âm tính cho màu vàng; GEL dương tính cho màu đen bị khuếch tán.
- Kiểm tra khả năng đồng hóa các hợp chất cịn lại bằng cách dựa vào độ đục, phản ứng dương tính cho độ đục cao.
- Kết quả ghi lại và được phân tích với phần mềm của hãng BioMérieus. Tiến hành với Kit API 50CH.
- Lấy một vài khuẩn lạc nhất định cho vào ống API 50CHB/E sao cho OD600nm của dung dịch trong ống đạt 0,451.
- Thêm 0,2ml dung dịch trên vào các giếng.