3.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng một số hợp chất clo
Từ các mẫu đất và nước thu được tại các khu vực khác nhau tại vườn hoa Sơn Đồng, sau 2 lần làm giàu liên tiếp (5 ngày/lần) trên môi trường MGB lắc ở 30C, 160rpm, dịch làm giàu được cấy trải trên môi trường thạch MGB thạch bổ sung các loại cơ chất khác nhau với các nồng độ tương ứng 1,2- DCE nồng độ 5mM, 2,2-DCPS nồng độ 20mM và cơ chất 3,4-DCA nồng độ 50mg/l.
Sau thời gian từ 3 đến 5 ngày nuôi cấy trên mơi trường MGB có bổ sung cơ chất khác nhau chúng tôi đã thu được kết quả như trình bày ở bảng 4, 5, 6. Kết quả nghiên cứu cho thấy cho thấy chúng tôi không phân lập được chủng vi nấm nào mọc trên mơi trường chọn lọc, vì thế chúng tơi lựa chọn đối tượng là các chủng vi khuẩn trong các nghiên cứu tiếp theo. Định hướng sử dụng vi khuẩn trong phương pháp sinh học cho việc phân giải hợp chất Halogen cũng là hướng nghiên cứu chủ yếu trong các cơng trình cơng bố trước đây [6].
Bảng 4. Đặc điểm các khuẩn lạc trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 3,4- DCA
STT Kí hiệu Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc Đƣờng kính (mm)
Mẫu nước 8 chủng
1 NA1 Trịn, bóng, có tâm ở giữa Trắng ngà 1,0-1,5 mm 2 NA2 Dẹt, khơ, có tâm ở giữa Vàng nhạt Không xác định
3 NA3 To, bóng Vàng nhạt Khơng xác định
4 NA4 Trịn, bóng, dẹt, rìa KL nhăn nheo
Trắng ngà 2,0 mm
5 NA5 Tròn dẹt Trắng ngà 1,5 mm
6 NA6 Trịn, bóng, lồi, KL rất bé Trắng trong
7 NA7 Bóng, dẹt, rìa phẳng Trắng ngà Khơng xác định 8 NA8 Khuẩn lạc rất bé, lồi Vàng nhạt
1 DA1 Trịn, to, dẹt, bóng Trắng trong 3,0 mm 2 DA2 Dẹt, bóng, rìa khuẩn lạc có
rãnh
Trắng trong Khơng xác định
3 DA3 Tròn, dẹt, bé Trắng sữa 0,3 mm
4 DA4 To, dẹt, bóng Trắng trong Không xác định 5 DA5 Bé, dẹt, khô Trắng trong Không xác định 6 DA6 Trịn, dẹt, khơ, nhẵn Trắng đục 1,0 mm
7 DA7 Trịn, lồi, bóng, bề mặt nhẵn, có tâm
Trắng sữa 0,3 mm
8 DA8 Trịn, lồi, bóng Cam nhạt 0,5 mm
9 DA9 Trịn, dẹt, bóng Trắng sữa 0,8 mm
Trên mơi trường MGB có bổ sung cơ chất 3,4-DCA chúng tơi đã phân lập được 17 loại khuẩn lạc khác nhau trong đó có 9 chủng từ mẫu đất và 8 chủng từ mẫu nước. Các khuẩn lạc hầu hết có hình trịn, màu trắng sữa, có một vài khuẩn lạc màu cam đến vàng nhạt, nhìn chung đường kính khuẩn lạc dao động từ 0,3 đến 3,0mm. Một số khuẩn lạc khơng xác định được đường kính do có hình tia hoặc chia thùy.
Hình 6. Ảnh khuẩn lạc trên môi trường MGB cơ chất 3,4-DCA
Bảng 5. Đặc điểm các khuẩn lạc trên mơi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2- DCPS
STT Kí hiệu Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc Đƣờng kính (mm)
Mẫu nước 3 chủng
1 NP1 Tròn, bé, lồi, bề mặt khô Trắng sữa 0,5 mm 2 NP2 Trịn, lồi, bóng Trắng sữa 1,0-1,5 mm
3 NP3 Rất bé, bóng Trắng trong
Mẫu đất 7 chủng
1 DP1 Trịn, lồi, bóng Trắng sữa 1,5 mm
2 DP2 Tròn, lồi, bề mặt khô, tâm ở giữa Trắng sữa 1,2-1,5 mm 3 DP3 Trịn, lồi, bé, bóng Trắng ngà 0,5 mm 4 DP4 Tròn, nhỏ, bóng Trắng trong 0,3 mm 5 DP5 Trịn, dẹt, bóng Trắng sữa 1,0-1,3 mm 6 DP6 Rất bé, lồi, bóng Trắng trong 7 DP7 Trịn, bé, lồi, bóng Trắng sữa 0,2-0,4 mm Trên mơi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2-DCPS chúng tôi đã chọn được 10 loại khuẩn lạc khác nhau đó có 7 chủng phân lập từ mẫu đất và 3 chủng phân lập từ mẫu nước. Hầu hết các khuẩn lạc có hình trịn, màu trắng sữa đến trắng ngà, đường kính khuẩn lạc nhỏ từ 0,2 đến 1,5mm.
Bảng 6. Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường MGB bổ sung cơ chất 1,2-DCE
STT Kí hiệu Hình dạng khuẩn lạc Màu sắc Đƣờng kính (mm)
Mẫu nước 9 chủng
1 NE1 Trịn, to, dẹt, bóng, có tâm ở giữa
Trắng sữa 3,0 mm
2 NE2 To, lồi, bóng, rìa răng cưa. Trắng sữa Khơng xác định 3 NE3 To, dẹt, bóng. Trắng ngà Không xác định. 4 NE4 Trịn, lồi, bóng Trắng trong 1,0 mm
5 NE5 Dẹt, khơ, có tâm ở giữa Trắng ngà Khơng xác định 6 NE6 Trịn, bé, lồi, bóng. Trắng sữa 0,5 mm
7 NE7 Trịn, rất bé, lồi, khơ. Trắng sữa 0,2-0,3 mm 8 NE8 Rất bé, khơ, có tâm ở giữa
9 NE9 Dẹt, khô Trắng đục Không xác định.
Mẫu đất 5 chủng
1 DE1 Trịn, bóng, nhầy. Vàng nhạt 1,5 mm
2 DE2 To, dẹt, rìa răng cưa. Trắng ngà Khơng xác định 3 DE3 Trịn, to, lồi, bóng Trắng ngà 3,0 mm
4 DE4 Rất bé, lồi, khô Trắng trong Không xác định 5 DE5 Trịnm, bóng, lồi Trắng sữa 2,0 mm
Tương tự, 14 chủng chúng tôi phân lập được từ mơi trường MGB có bổ sung cơ chất 1,2-DCE như trình này ở bảng trên cho thấy phần lớn các khuẩn lạc bóng, dẹt, có nhiều khuẩn lạc kích thước ko xác định.
Hình 8. Ảnh khuẩn lạc trên mơi trường MGB có bổ sung cơ chất 1,2-DCE
Như vậy, từ các mẫu đất và nước thải thu được từ Sơn Đồng, huyện Hồi Đức, Hà Nội chúng tơi đã phân lập được tổng số 41 chủng vi sinh vật trên môi trường chọn lọc MGB thạch có bổ sung 3 loại cơ chất khác nhau. Số lượng chủng phân lập trên mỗi cơ chất được tóm tắt ở bảng 7.
Bảng 7. Số lượng các chủng vi sinh vật phân lập được
Cơ chất Môi trƣờng thạch MGB
Mẫu nƣớc Mẫu đất
3,4-DCA 8 chủng 9 chủng
2,2-DCP 3 chủng 7 chủng
1,2-DCE 9 chủng 5 chủng
3.2. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất clo
Từ 41 chủng vi khuẩn phân lập chúng tôi tiến hành tuyển chọn các đại diện cho khả năng phân hủy cao đối với từng hợp chất chứa clo. Các chủng được tuyển chọn cần đáp ứng 2 tiêu chí đó là có khả năng sinh trường tốt trên môi trường chọn lọc MGB bổ sung cơ chất đồng thời có khả năng phân giải mạnh hợp chất clo thể hiện qua mức độ chuyển màu mạnh nhất trên mơi trường thạch MGB có bổ sung Bromothymol blue.
Các khuẩn lạc phân lập được sau 3 ngày nuôi lắc trên môi trường MGB ở 30oC, 160rpm, dịch nuôi cấy được đo mật độ tế bào ở OD 620nm để xem khả năng
sinh trưởng và phát triển. Trên mơi trường MGB có bổ sung cơ chất 3,4-DCA, kết quả cho thấy một số chủng NA1, NA4, NA7, DA1 có khả năng phát triển mạnh. Tuy vậy, kết hợp với kết quả chuyển màu trên môi trường thạch bổ sung Bromothymol blue (75mg/l) chúng tôi đã chọn ra được chủng NA4 với khả năng chuyển màu môi trường từ màu xanh sang màu vàng rõ rệt nhất.
Tương tự như quá trình tuyển chọn bằng các thí nghiệm như cơ chất 3,4- DCA, đối với khả năng phân giải cơ chất 2,2-DCPS, 1,2-DCE chúng tôi đã lựa chọn được lần lượt 2 chủng NP2 và DE1 cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 9. Ảnh phát triển khuẩn lạc trên môi trường MGB bổ sung Bromothymol
blue và hợp chất clo tương ứng của 3 chủng NP2, NA4 và DE1
3.3. Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu 3.3.1. Nhuộm Gram 3.3.1. Nhuộm Gram
Để bước đầu phân loại 3 chủng nghiên cứu chúng tôi tiến hành nhuộm Gram, kết quả thể hiện như ở hình 10.
NA4
NP2
Hình 10. Ảnh hình thái các chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học với độ
phóng đại 100
Kết quả nhuộm Gram cho thấy chủng NA4 và NP2 bắt màu hồng với thuốc nhuộm, còn chủng DE1 bắt màu tím với thuốc nhuộm. Bước đầu phân loại chủng NA4 và NP2 là vi khuẩn Gram (-), chủng DE1 là vi khuẩn Gram (+). Hình thái tế bào chủng NA4 và NP2 đều có hình dạng que ngắn, trong đó chủng NA4 có kích thước tế bào khá lớn, dễ dàng nhìn thấy hình dạng tế bào khi soi dưới kính hiển vi. Chủng DE1 có dạng tế bào hình cầu và các tế bào tập trung thành từng đám (hình 10).
3.3.2. Chụp hiển vi điện tử quét 3 chủng nghiên cứu.
Để quan sát kỹ hơn các đặc điểm hình thái tế bào chúng tơi tiến hành chụp ảnh tế bào trên kính hiển vi điện tử quét JSM–5421LV đối với 3 chủng nghiên cứu.
NA4 NP2 DE1 111 111 111 1
Hình 11. Ảnh hình thái các chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét với độ
phóng đại 10000
Kết quả từ hình 11 cho thấy hai chủng NA4 và NP2 có hình que ngắn, tế bào chủng NA4 có kích thước khoảng 1,8 µm ± 0,3 µm, kích thước tế bào chủng NP2 khoảng 2 µm ± 0,5µm. Ảnh chụp chủng DE1 cho thấy rõ tế bào dạng hình cầu, có đường kính khoảng từ 0,8± 0,2µm, các tế bào tụ lại từng khối với nhau (hình 11).
3.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa các chủng nghiên cứu bằng sử dụng kit thử API API
Kit API của hãng Biomeriux được sử dụng để nghiên cứu đặc điểm hóa sinh của các chủng vi khuẩn thơng qua việc đánh giá khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ từ đó có cơ sở phân loại các chủng nghiên cứu.
Đối với 2 chủng NA4 và NP2 chúng tôi sử dụng kit API 20NE đặc trưng cho nhóm vi khuẩn Gram (-). Ngồi ra, chúng tơi sử dụng chủng E.coli được cung cấp bởi phòng bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên làm đối chứng. Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 8.
NA4 NP2 DE1 111 111 111 1
Bảng 8. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nghiên cứu (kit API 20NE) Khả năng sử dụng các loại hợp chất Chủng NP2 Chủng NA4 E. Coli
Potassium nitrate + + +
L-tryptophane - - _
D-glucose + + +
L-arginine - - -
Urea + + -
Esculin ferric citrate + + +
Gelatin (bovine origin) + - +
4-nitrophenyl- D-galactopyranoside + + + D-glucose + + + L-arabinose + + + D-mannose + + + D-mannitol + + + N-acetyl-glucosamine + + + D-maltose + + + Potassium gluconate + - + Capric acid - - _ Adipic acid - - _ Malic acid + + _ Trisodium citrate + + _ Phenylacetic acid + + + Chú thích: (-) Khơng sử dụng; (+) Có sử dụng
Kết quả cho thấy, so với đối chứng E. coli là một vi khuẩn gram (-) điển
hình, 2 chủng NA4 và NP2 đều có khả năng chuyển hóa từ nitrate sang nitrite, khả năng lên men glucose, thủy phân Esculin và khả năng đồng hóa đường glucose, arabinose, mannose, mannitol. Bên cạnh đó, E.coli khơng sinh urea và khơng có khả năng sử dụng citrate, cịn NA4 và NP2 thì lại cho phản ứng dương tính. Đây là hai trong những đặc điểm sinh hóa rất đặc trưng của vi khuẩn thuộc chi Klebsiella [57].
độ tin cậy cao khi chúng tôi sử dụng phần mềm của hãng Biomeriux để xác định sơ bộ chi của 2 chủng phân lập được.
Đối với chủng DE1, để xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa chúng tơi sử dụng kit thử API 50CHB sử dụngmcho nhóm vi khuẩn Gram (+). Theo quy trình thực hiện thí nghiệm như đã trình bày ở phần phương pháp, chúng tơi đã thu được kết quả như ở bảng 9.
Bảng 9. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nghiên cứu (kit API 50CHB) Khả năng sử dụng các loại hợp chất Chủng DE1 B. subtilis
Đối chứng - - Glycerol - + Erythritol - - D- arabinose - - L- arabinose + + Ribose - - D- Xylose - - L- Xylose - - Adonitol - - β- Methyl- D- Xylose - - Galactose + - Glucose + + Fructose - + Mannose - + Sorbose - - Rhamnose - - Dulcitol - - Inositol - + Mannitol - + Sorbitol - + α- Methyl- D- Mannoside - -
α- Methyl- D- Glucoside - - N- Acetyl- Glucosamine - - Amygdalin - - Arbutin - + Esculin + + Salicin + + Cellobiose + + Maltose + + Lactose + - Melibiose + - Sucrose + + Trehalose + + Inulin - - Melezitose - - Raffinose - - Starch (Amidon) - + Glycogen - + Xylitol - - Gentiobiose - - D- Turanose + - D- Lyxose - - D- Tagatose - - D- Fucose - - L- Fucose + - D- Arabitol - - L- Arabitol - - Gluconate - - 2- Keto- Gluconate - - 5- Keto- Gluconate - -
Kết quả thử kit API 50CHB ở bảng trên cho thấy chủng DE1 có khả năng sử dụng đa dạng các loại đường. Đây là cơ sở sinh hóa quan trọng để chủng vi sinh vật nghiên cứu có thể sử dụng được các cơ chất chứa clo hữu cơ khi bổ sung vào mơi trường ni cấy, từ đó chuyển hóa từ các hợp chất có tính độc thành các chất khơng cịn độc với mơi trường.
3.5. Phân loại các chủng bằng phương pháp giải trình tự gen 16S ARNr
Các chủng vi khuẩn được cấy không quá 24 giờ để đảm bảo chất lượng ADN cho giải trình tự gen. Kết quả giải trình tự 16S ADNr của các chủng nghiên cứu được so sánh với các trình tự gen 16S ARNr trong ngân hàng gen quốc tế dựa vào phần mềm Clustal X. Trên cơ sở đó, xây dựng cây phát sinh chủng loại và xác định vị trí phân loại.
Hình 12. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng NA4
So sánh trình tự đoạn gen mã hóa16S ARNr của chủng NA4 với các trình tự tương ứng đã được công bố trên Ngân hàng gen thế giới cho thấy, chủng vi khuẩn NA4 tương đồng 99% với lồi Klebsiella Pseudomonia.
Hình 13. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng NP2
Trình tự đoạn gen mã hóa16S ARNr của chủng NP2 tương đồng 99% với chủng Klebsiella oxytoca.
Hình 14. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng DE1
Trình tự đoạn gen mã hóa16S ARNr của chủng DE1 tương đồng 99% với chủng Staphylococcus sciuri.
Kết quả phân loại này trùng với các kết quả phân loại dựa trên đặc điểm hình thái tế bào, sinh lý sinh hóa trước. Các chủng phân lập được khơng có nhiều các nghiên cứu trước đây trong việc phân giải các hợp chất clo.
3.6. Ảnh hƣởng của một số điều kiện môi trƣờng lên khả năng sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu
Việc nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên khả năng sinh trưởng của vi sinh vật là cần thiết để tìm ra các điều kiện sinh trưởng tối ưu cho vi sinh vật. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 3 yếu tố thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, nồng độ hợp chất clo đối với sự sinh trưởng của các chủng nghiên cứu. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tăng độ chính xác của các kết luận đưa ra.
3.6.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy.
Tiến hành nuôi cấy lắc chủng NP2 trên mơi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2-DCPS 20mM trong 4 ngày, đo mật độ quang học tại OD 620nm sau từng ngày nuôi cấy chúng tơi thu được kết quả trình bày trên hình 15.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 1 2 3 4
Thời gian (ngày)
K hả nă ng s inh t rư ở ng (O D 6 20 nm ) NP2
Hình 15. Ảnh hưởng của thời gian ni cấy lên sự sinh trưởng của chủng NP2
Đồ thị biểu hiện mức sinh trưởng của chủng NP2 mạnh nhất ở ngày nuôi cấy thứ 2. Đối với chủng NA4, khi ni cấy trên mi trường MGB có bổ sung 25mg/l cơ chất 3,4-DCA trong thời gian 12 ngày, qua giá trị OD 620nm nhận được sau từng ngày ni cấy (hình 16), chúng tơi kết luận chủng NA4 sinh trưởng mạnh nhất sau 10 ngày nuôi cấy.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 2 4 6 8 10 11 12
Thời gian (ngày)
K hả nă ng s inh t rư ở ng (O D 6 20 nm ) NA4
Hình 16. Ảnh hưởng của thời gian ni cấy lên sự sinh trưởng của chủng NA4
Nuôi cấy chủng DE1 trên môi trường MGB bổ sung 5mM cơ chất 1,2-DCE trong các khoảng thời gian khác nhau, kết quả biểu thị ở hình 16 cho thấy thời gian sinh trưởng tốt nhất của chủng DE1 là sau 12 giờ.
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45