CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Thiết kế và tối ƣu quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD
3.2.1. Thiết kế trình tự mồi
Trong đề tài này, cặp mồi đặc hiệu nhằm nghiên cứu đột biến FLT3- ITDđược thiết kế dùng cho phản ứng PCR để nhân một đoạn gen có kích thước 330
M 182 183 184 185 186 187 188 189 190 10000 bp 2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp
bp, kéo dài từ intron 11 đến exon 12 (dựa theo nghiên cứu của tác giả Hitoshi Kiyoi và cộng sự, năm 1999)[27]. Trình tự của cặp mồi như sau:
11F: 5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’ 12R: 5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’
Chiều dài mồi xuôi cũng như mồi ngược là 23 Nucleotide, vừa đảm bảo tínhđặc hiệu (mồi bắt cặp với gen 100%), vừa tránh được sự tạo cấu trúc bậc 2.Thành phần base có tổng (G + C) của mồi xi và mồi ngượclần lượtlà 43,5 % và 47,8%, cũng là một yếu tố đảm bảo tính đặc hiệu cho phản ứng PCR.Hai mồi có đầu 3’ của mồi là G hoặc C đảm bảo tính ổn định và độ bền cao.Nhiệt độ gắn mồi (Tm) là 56o
Ctrong giới hạn thích hợp (52oC – 65oC) và khơng có sự cách biệt q lớn giữa 2 mồi, giúp cho phản ứng PCR đạt hiệu quả cao nhất.
3.2.2. Thiết kế và tối ƣu quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITD
Quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITDđược thiết lập gồm các bước sau: (1) Nhân đoạn gen FLT3 có kích thước 330bp với cặp mồi đặc hiệu, sử dụng phản ứng PCR; (2) điện di trên gel agarose 2%;(3) phân tích và khẳng định kết quả. Quy trình có thể tóm tắt như sau:
Hình 3.2: Quy trình phát hiện đột biến FLT3-ITD
Quy trình được thử nghiệm với 36 mẫu bệnh đầu tiên và 3 mẫu người thường làm đối chứng. Điện di sản phẩm PCR sử dụng ADN tổng số tách từ mẫu máu của người thường trên gel agarose 2%, kết quả cho thấy có 1 băng duy nhất, có kích
Nhân đoạn gen FLT3 kích thước 330bp với cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR
Điện di sản phẩm thu được trên gel agarose 2%, sau đó nhuộm ethidium và soi trên máy có tia UV
Phân tích kết quả thu được và đưa ra kết luận. Khẳng định kết luận bằng cách đưa đoạn ADN vào vecto tái tổ hợp và đọc trình tự
thước xấp xỉ 330 bp, sắc nét, khơng xuất hiện băng khơng đặc hiệu (Hình 3.3). Kết quả điện di 36 mẫu bệnh cho thấy, 35/36 mẫu đều xuất hiện một băng điện di sắc nét, giống như mẫu đối chứng của người thường, riêng mẫu 20 ngoài một băng giống băng của người thường và có kích thước tương đương còn xuất hiện thêm 1 băng sắc nét, có kích thước lớn hơn 330 bp. Đây có thể là băng chứa đột biến FLT3- ITD. Kết quả nhân dòng của băng có kích thước lớn hơn đó (cắt khỏi bản gel, tinh sạch, đưa vào vectơ tái tổ hợp) và giải trình tự cho thấy chính xác là mẫu 20 có trình tự giống với trình gen FLT3 bình thường nhưng có chứa thêm một lặp đoạn 33 bp. Như vậy, mẫu 20 có chứa đột biến lặp đoạn FLT3-ITD và được sử dụng làm mẫu đối chứng dương cho q trình sàng lọc 164 mẫu cịn lại.Quy trình có thể ứng dụng để sàng lọc các đột biến lặp đoạn trên gen FLT3.
Hình 3.3: Điện di sản phẩm PCR một số mẫu máu (19-32)
M: marker 100bp
19-32: mẫu ADN từ bệnh nhân AML (-1): mẫu đối chứng của người thường (-2): đối chứng âm của phản ứng PCR
Trong phản ứng PCR, một số thành phần (nồng độ mồi, nồng độ enzyme, nồng độ ADN,…) sẽ gây ảnh hưởng đến kết quả của quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD.Theo nghiên cứu củaKiyoi năm 1999[26],nồng độ mồiđã sử dụng là 2 pmol, nhưng khi sử dụng nồng độ đó với ADN đã tách, mồi thừa rất nhiều, tạo thành băng hoặc vệt trong bản điện di. Do vậy, tác giả đã tiến hànhthử nghiệm
300 bp 400 bp
nhiều giá trị khác nhau, nhằm tối ưu đến một giá trị đạt hiệu quả cao nhất về khoa học cũng như về mặt kinh tế. Sau khi thực hiện các phản ứng PCR với nồng độ mồi khác nhau, kết quả điện di cho thấy sử dụng nồng độ mồi là 0,4 pmol, phản ứng PCR vẫn cho kết quả tốt, không bị thừa mồi sau phản ứng. Vì vậy, các phản ứng PCR tiếp theo sẽ được thực hiện với nồng độ mồi là 0,4 pmol.
Tương tự như vậy, ban đầu quy trình sử dụng enzyme Taq polymerase sản xuất tại Phịng Thí nghiệm Trọng điểmvới thể tích là2,5µl/1 phản ứng (25µl). Tuy vậy, trong dung dịch enzyme lại chứa nhiều chất bảo quản enzyme như glycerol, tris-HCl, NaCl, EDTA,…Nếu sử dụng enzyme với tỉ lệ thể tích là 1:10 của phản ứng như vậy, những chất đó có ảnh hưởng lớn đến kết quả phản ứng. Do đó, một loại Taq polymerasekhác là Dream Taq (Fermentas) được sử dụng thay thế, với thể tích là 0,2µl/ 25µltrong 1 phản ứng, có tỉ lệ là 1: 125 nên ít làm thay đổi thành phần phản ứng PCR, giúp phản ứng PCR đạt hiệu cao hơn.
Thêm vào đó, trongnhiều trường hợp kích thước đoạn lặp rất nhỏ khiến băng đột biến rất gần với băng thườngnên gặp khó khăn trong việc xác định có chứa đột biến hay khơng. Ngun nhân của vấn đề đó có thể do thể tích ADN tổng số khi cho vào phản ứng PCR là giống nhau, nhưng nồng độ lại khác nhau, và những mẫu lên băng quá đậm thường tương ứng với những mẫu có nồng độ cao hơn nhiều so với những mẫu khác. Từ đó, pha lỗng ADN tổng số về một khoảng nồng độ thích hợp nhằm tránh các trường hợp trên. Nhiều mẫu được thực hiện PCR lại sau khi pha loãng nồng độ ADN tổng số đã xuất hiện 2 băng mảnh, tách rời nhau, thay vì một băng đậm như ban đầu. Qua nhiều lần lặp lại thí nghiệm, kết quả cho thấy nồng độ ADN tổng số tốt nhất sử dụng cho phản ứng PCR trong quy trình trên là 40-50 ng/µl nhằm đạt nồng độ cuối cùng là 4,8 -6 ng/µl sau khi bổ sung vào dung dịch phản ứng.
Như vậy, sau nhiều bước tối ưu, quy trình đã được hồn thiện với các thành phần và các bước đã trình bày trong chương 2 và được ứng dụng để sàng lọc trong quy mơ phịng thí nghiệm với các mẫu cịn lại.