CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4. Kết quả đƣa sản phẩm PCR vào vectơ tái tổ hợp
Các băng ADN có kích thước lớn hơn 330 bp (Hình 3.4)được tinh sạch và kiểm tra lại bằng 2 cách: điện di trực tiếp và PCR lại với cặp mồi FLT3 đặc hiệu đã sử dụng ban đầu. Một số mẫu có nhiều hơn một băng đột biến cũng được tách riêng các băng, và tinh sạch, trong đó, băng có kích thước lớn hơn nhưng gần băng thường hơn kí hiệu là d (53d, 60d, 88d), cịn băng có kích thước lớn hơn băng thường và băng d kí hiệu là t (53t, 60t, 88t) (Hình 3.5).
Đa số các sản phẩm ADN tinh sạch được điện di trực tiếp đều thể hiện trên bản điện di là một băng sắc nét, thường có nồng độ từ khoảng 20-30 ng/µl, thường đạt hiệu suất 30-40% so với ban đầu (Hình 3.5). Kết quả PCR cũng cho thấy một băng giống với băng ban đầu, chứng tỏ mẫu đã được tinh sạch.
Hình 3.5: Kết quả điện sản phẩm ADN tinh sạch từ gel
M: Marker 100 bp
Sản phẩm ADN tinh sạch của một số mẫu đã được gửi đi đọc trình tự trực tiếp.Kết quả đọc trình tự cho thấy việc đọc trình tự trực tiếp từ sản phẩm ADN tinh sạch từ gel như vậy có độ chính xác khơng cao, có thể thừa hoặc thiếu Nucleotide hoặc có thể đọc nhầm Nucleotide. Kết quả này thể hiện rõ ở mẫu 71, mặc dù có sự khơng chính xác như vậy, nhưng vẫn có thể xác định được đoạn ADN lặp đột biến trong gen FLT3, đoạn lặp có kích thước là 32 bp.
Nhằm tránh sự sai lệch của phương pháp đọc trình tự trực tiếp, ADN tinh sạch đã được nhân dòng (gồm các bước gắn vào vectơ PGEMTEZ EASY, biến nạp vào tế bào khả biến DH5α, nuôi cấy trên môi trường thạch). Kết quả nhân dòng được chọn lọc bằng phương pháp trắng xanh và PCR với mồi pUC19 đặc hiệu trước khi gửi đi đọc trình tự.
Theo phương pháp chọn lọc trắng xanh, những khuẩn lạc có màu trắng là những khuẩn lạc có khả năng mang đoạn chèn sẽ được chọn cho bước sàng lọc tiếp theo. Đối với phương pháp PCR bằng mồi pUC19 đặc hiệu bắt cặp với vectơPGEMTEZ, sản phẩm tạo ra nếu khơng có đoạn chèn có kích thước là 309 bp,
M 53t 53d 60t 60d 88t 88d 69 102
500 bp 400 bp 300 bp
700bp 600 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 nhưng khi có đoạn chèn (đoạn ADN có kích thước lớn hơn 330 bp)thì sản phẩm PCR có kích thước từ hơn 600 bp đến khoảng 700bp). Kết quả kiểm tra khuẩn lạc bằng PCR được thể hiện trong hình 3.6 như sau:khuẩn lạc số1,2, 7, 9,16 là những khuẩn lạc chứa plasmid có đoạn chèn do băng có kích thước nằm giữa 600 – 700 bp, còn khuẩn lạc số 3-6,8,10-15 là những khuẩn lạc chứa plasmid khơng có đoạn chèn do băng có kích thước khoảng 300 bp (Hình 3.6).
Hình 3.6: Kiểm tra ADN trong khuẩn lạc bằng PCR
M: marker 100bp
1-16: sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc với mồi pUC19
Các mẫu nhân dịng thành cơng và đọc được trình tự chính xác của đoạn gen chứa đột biến FLT3-ITD có số thứ tự là : 20, 57, 60d, 69,88t, 146.Việc đưa đoạn ADN vào vectơ chưa thành cơng với tồn bộ các mẫu chứa băng có kích thước lớn hơn 330 bp như vậy có thể được giải thích là do enzyme T4 ligase cần điều kiện tối ưu để xúc tác được phản ứng nên phải thực hiện tối ưu rất nhiều lần; do đoạn ADN cần đã tách được nhưng có thể đã bị mất đầu A trong quá trình thao tác, dẫn đến không thể gắn vào vectơ được.