Cơng cụ chính trong cơng nghệ sinh học hiện đại là công nghệ DNA tái tổ hợp hay còn gọi là kỹ thuật di truyền. Công nghệ này cho phép thao tác trực tiếp trên các nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt. Bằng cách đưa các thông tin di truyền ngoại lai vào trong các cơ thể vi sinh vật, các tế bào động vật và thực vật sinh trưởng nhanh, chúng ta có thể sản xuất ra các sản phẩm của gen ngoại lai (các protein) với các tốc độ và hiệu suất cao hơn mà thường không thể thực hiện ở các hệ thống tế bào khác.
Hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn E. coli có rất nhiều ưu điểm quan trọng để đáp ứng là một vật chủ thích hợp cho q trình biểu hiện gen ngoại lai như: dễ nuôi cấy;
môi trường, trang thiết bị, dụng cụ ni cấy đơn giản và khơng tốn kém. Do đó, góp phần hạ giá thành sản phẩm; tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp. Bên cạnh đó, hệ thống biểu hiện DNA tái tổ hợp ở vi khuẩn vẫn còn tồn tại một số điểm hạn chế. Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào cực kỳ đơn giản, do đó, khơng giống như các cơ thể đa bào, các vi khuẩn khơng có khả năng tiến hành các biến đổi hóa học đặc hiệu đối với protein sau khi protein đã được dịch mã từ trình tự DNA. Trong khi đó, hầu hết các protein trị liệu ở người lại cần các dạng biến đổi này để hồn thiện cấu hình khơng gian chức năng của chúng.
Để khắc phục những điểm yếu khi biểu hiện gen ở vi khuẩn, các hệ thống biểu hiện là các sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, chẳng hạn như nấm men (ví dụ,
Saccharomyces cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) đang ngày
càng được sử dụng rộng rãi. Ưu điểm của nấm men là chúng có thể tiến hành rất nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá đơn giản, không sản sinh nội độc tố và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy mô lớn. S. cerevisiae là nấm men được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các protein tái tổ hợp [9].
Hiện nay, hệ thống tế bào động vật có vú như tế bào thận người (Human Embryonic Kidney - HEK), tế bào thận chuột chưa trưởng thành (Baby Hamster Kidney - BHK) và tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc (Chinese Hamster Ovary - CHO) thường được lựa chọn để sản xuất các protein trị liệu cho người. Mặc dù, hệ thống này có rất nhiều nhược điểm như: sản lượng protein thu được khá thấp và giá thành sản xuất các sản phẩm sử dụng các hệ thống này khá cao, do tốc độ sinh trưởng của tế bào chậm và môi trường nuôi cấy đắt tiền nhưng trong nhiều trường hợp tạo protein tái tổ hợp nó vẫn là lựa chọn duy nhất.
Trong nghiên cứu này chúng tôi cũng chọn hệ biểu hiện là tế bào động vật (HEK293) để biểu hiện enzyme NQO1 do enzyme này cũng cần phải trải qua quá trình dimer để thực hiện được chức năng xúc tác. HEK293 là một dịng tế bào có nguồn gốc từ tế bào thận phôi người phát triển trong nuôi cấy mơ. Dịng đặc biệt
này được khởi xướng bởi sự chuyển đổi và ni các tế bào HEK bình thường với cài DNA adenovirus 5. Việc chuyển đổi dẫn đến sự kết hợp của khoảng 4,5 kilobases từ bộ gen của virus vào nhiễm sắc thể 19 của các tế bào HEK. Dịng tế bào HEK đã được ni bởi nhà khoa học Alex Vander Eb, trong những năm 1970, tại phịng thí nghiệm của ơng tại Đại học Leiden, Hà Lan. Việc chuyển nhiễm được thực hiện bởi Frank Graham, một nhà khoa học trong phịng thí nghiệm Vander Eb, người phát minh ra phương pháp calcium phosphate cho transfecting tế bào. Tên HEK293 được đặt vì đó là thí nghiệm 293 của Frank Graham. Là một dịng tế bào thực nghiệm, HEK293 dễ dàng thao tác với nuôi cấy và biến nạp đơn giản và có thể được sử dụng trong các thí nghiệm hoạt động của tế bào cần quan tâm. Thơng thường các thí nghiệm biến nạp một gen quan tâm và sau đó phân tích sự biểu hiện của protein. Dòng tế bào được sử dụng rộng rãi do khả năng chuyển nhiễm dễ dàng bằng các kỹ thuật khác nhau, bao gồm cả calcium phosphate, lipofectamine, hiệu suất biến nạp gần 100%. Một biến thể quan trọng của dòng tế bào này là dòng 293T chứa thêm T-antigen (kháng thể) SV40 large, cho phép episomal sao chép plasmid có vùng origin SV40 được nhân lên [65].
Đi kèm với hệ thông biểu hiện trong tế bào động vật là một hệ thống vector biểu hiện hỗ trợ cho việc biểu hiện các protein ngoại lai nhằm nâng cao sản lượng protein cần biểu hiện như các hệ thống vector pcDNA3.1, p CMV/hygro, p MAM- neo cho kết quả tốt. Các hệ thống vector biểu hiện này cịn giúp cho q trình phát hiện, thu hồi và tinh sạch protein cần biểu hiện một cách dễ dàng và nhanh chóng. Nghiên cứu này của chúng tôi lựa chọn thiết kế sử dụng vector biểu hiện pcDNA3.1B his-myc để tách dòng và biểu hiện gen NQO1 trong tế bào động vật HEK293.