pcDNA3.1 myc-his B (5497bp) là một vector thuộc hệ thống pcDNA kết quả nghiên cứu của Invitrogen, vector này được thiết kế nhằm biểu hiện, tinh sạch và phát hiện các protein tái tổ hợp ở các dịng tế bào động vật có vú. Biểu hiện có mức ổn định cao được thực hiện ở hầu hết các tế bào động vật. Ưu điểm của vector nằm
ở chỗ với một đi C-terminal mã hóa cho epitop myc và một peptide polyhistidine liên kết kim loại. Đuôi polyhistidine là một phần protein gồm 6 acid amin histidine (CAC hoặc CAT) được gắn vào đầu C của protein thường được gọi hexa histidine- tag hay 6xHis-tag. Các đuôi polyhistidine được thêm vào đầu N sau Methionine hoặc đầu C trước một stop codon, trong trình tự mã hóa của protein quan tâm. Sử dụng exopeptidases có thể loại bỏ các đi His từ đầu N, loại bỏ các đi đầu C sẽ địi hỏi việc sử dụng các kỹ thuật khác.
Có hai cách để thêm polyhistidines. Đơn giản nhất là để chèn DNA mã hóa các protein trong một vector mã hóa một his-tag để nó sẽ được tự động gắn liền với một trong những kết thúc của nó. Kỹ thuật khác là để thực hiện một phương pháp PCR với mồi là codon lặp đi lặp lại của his ngay bên cạnh codon start hoặc stop ngoài một số nucleotide (16 trở lên) căn cứ từ một đầu của DNA mã hóa các protein được gắn đuôi.
Đuôi his thường được sử dụng để tinh sạch protein tái tổ hợp có gắn đi his biểu hiện ở E. coli và các hệ thống biểu hiện khác thơng qua phương pháp sắc kí ái lực sau đó độ tinh sạch và lượng protein được đánh giá bởi SDS-PAGE và Western blotting. Các đuôi his cũng được dùng để phát hiện protein thông qua kháng thể anti-histidine tag hoặc nhuộm gel SDS-PAGE với đầu dò huỳnh quang mang ion kim loại. Điều này rất hữu ích cho việc xác định vị trí khu trú protein trong tế bào bằng phương pháp phân tích miễn dịch huỳnh quang hay ELISA, Western blotting.
Đối với hệ thống biểu hiện trong tế bào động vật, để tăng độ tinh sạch của protein được biểu hiện thường có 2 đi peptide được thiết kế trong vector. Ngoài đi His, vector cịn có thêm đi c-myc, một đoạn peptide có nguồn gốc từ gen c-
myc với chuỗi peptide N-EQKLISEEDL-C (1202 Da) có ứng dụng tương tự. Người
ta sử dụng kháng thể Anti-myc để phát hiện protein tái tổ hợp có được biểu hiện trong tế bào vật chủ hay không cũng như xác định vị trí của protein trong tế bào bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang hay Western Blotting.
Ngồi ra vector cịn mang các nhân tố di truyền giúp cho quá trình phát hiện tinh sạch
T7 promoter/priming (có nguồn gốc từ thực khuẩn thể T7) điều khiển quá trình phiên mã của gen ngoại lai. Đây là promoter hoạt động mạnh trong tế bào E.
coli.
Vị trí đa điểm (MCS) bao gồm các trình tự nhận biết của các enzyme giới hạn thông thường giúp đưa đoạn chèn vào vector biểu hiện trở nên thuận tiện cho tách dòng.
Trình tự BGH reverse priming giúp cho quá trình giải trình tự xun suốt đoạn chèn. Tín hiệu polydenylation của hormone sinh trưởng bò (BGH) và SV40 làm tăng hiệu suất kết thúc phiên mã và bổ sung chuỗi poly(A) của mRNA.
Trình tự gen kháng Neomycin đóng vai trị chọn lọc thể nhận ổn định trong các tế bào động vật.
Trình tự gen kháng Ampicillin (β-lactamase) giúp chọn lọc E. coli mang
vector.
Promoter sớm cytomegalovirus (CMV) giúp tăng cường biểu hiện protein tái
Hình 6. Cấu trúc vector biểu hiện pcDNA3.1myc-his B (+)
tổ hợp ở mức cao trong một loạt các dòng tế bào động vật.
Promoter SV40 (có nguồn gốc từ virus Simian vacuolating 40) làm tăng hiệu suất, biểu hiện mức cao gen kháng Neomycin và sự tái bản episomal trong các dòng tế bào được tiềm nhiễm với SV40.
Như vậy vector pcDNA 3.1 myc-his B (+) không những mang các đặc điểm thuận lợi cho việc tách dòng gen mà còn giúp cho việc biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp dễ dàng trong các dòng tế bào động vật.
1.5. Tình hình nghiên cứu protein tái tổ hợp ở tron nƣớc
Hướng nghiên cứu biểu hiện gen/protein có giá trị để tiến tới sản xuất sinh phẩm sử dụng trong y dược là hướng rất quan trọng, cấp thiết mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây. Một số phịng thí nghiệm đã tiến hành phân lập, xác định trình tự một số gen từ các nguồn sinh vật khác nhau, bao gồm các gen của người để nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất dược phẩm công nghệ sinh học. Viện Công nghệ Sinh học đã nghiên cứu biểu hiện và tinh chế được các protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật như: Trichobakin từ cây qua lâu, có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư [12]; protein bất hoạt ribosome (RIP) từ cây mướp đắng có hoạt tính kháng virus, nấm [6]. Viện cũng đã nghiên cứu tách dịng và biểu hiện gen mã hóa interleukin-2 của người với chaperon groesl và thioredoxin trong E. coli BL21 [13], rh-IL2MM dạng đột biến và kháng nguyên CD25 nhằm sử dụng trong điều trị và chẩn đoán ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng [1], [2]. Các nghiên cứu tạo vaccine tái tổ hợp cũng được quan tâm nghiên cứu ở các phịng thí nghiệm [4]. Một hướng nghiên cứu mới đang phát triển nhanh và rộng là biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào động vật. Trong đó, đề tài biểu hiện protein huỳnh quang (GFP) trong tế bào CHO-S đã được thực hiện làm công cụ cho các nghiên cứu hiện tượng trong tế bào và cơ thể [7]. Gần đây, nhóm nghiên cứu TS Nguyễn Thùy Dương đã nghiên cứu biểu hiện yếu tố hoạt hóa plasminogen mơ người (h-tPA) ở tế bào CHO [8, 11], hay nhóm nghiên cứu Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh đã hồn thành đề tài sản xuất protein erythropoietin thơng qua q trình chuyển gen trên tế bào CHO-K1 [3]. Thêm vào đó là các nghiên
cứu hợp tác trong và ngoài nước giữa các đơn vị như đánh giá sự biểu hiện của Cyp11b trong dòng tế bào HCT116 và COS-1 [10], biểu hiện gen yếu tố sinh trưởng nguyên bào sợi 10 người (HFGF-10) trong tế bào COS-7 [5].
ƣơn 2 ẬT LI À ƢƠNG Á NG ÊN ỨU 2.1. Vật liệu
Mẫu nghiên cứu
Tế bào JHH5, HEK293 từ Viện Nghiên cứu hệ gen – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Chủng vi sinh vật
Chủng E. coli DH10β của hãng Invitrogen được sử dụng để chọn dòng và nhân dòng gen.
Các vector
Vector tách dòng và biểu hiện: pcDNA3.1B his-myc (invitrogen)
Các cặp mồi
Các cặp mồi dùng để phân lập, chọn dòng và biểu hiện gen được thiết kế dựa trên trình tự cDNA chuẩn cơng bố trên Genbank (NM_000903.2) và đặt tổng hợp hãng IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
Bảng 2. Trình tự các cặp mồi được sử dụng. STT Tên mồi Trình tự nucleotide
1
NQO1-F-
HindIII 5’-CTGAAGCTTAGCCATGGTCGGCAGAAGAGC-3’
NQO1-R-
XhoI 5’-GGAACTCGAGTTTCTAGCTTTGATCTGGTTG-3’
Trong nghiên cứu này, chúng tơi thiết kế cặp mồi (F/R) để nhân tồn bộ cDNA mã hóa NQO1
Hóa chất
Các enzyme giới hạn HindIII, XhoI...; các hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR
(đệm, MgCl2, dNTPs, enzyme Taq DNA polymerase) được đặt mua tại hãng
Fermentas.
Các hóa chất dùng để tách RNA, DNA plasmid hay điện di protein của hãng BioRad (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merk (Đức).
Các bộ Kit tổng hợp cDNA, tinh sạch sản phẩm PCR, tinh sạch DNA plasmid... của hãng Promega (Mỹ), Invitrogen (Mỹ).
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được trình bày trong Bảng 3
Bảng 3. Mơi trường nuôi cấy các chủng vi sinh vật.
Môi trường (1 lít) pH
Cao nấm
men (g) Trypton (g) NaCl (g) Thạch (g) Hóa chất khác (g)
LB lỏng 7,0 5 10 10 NaOH: 0,144
LB đặc 7,0 5 10 10 15 NaOH: 0,144
Môi trường nuôi cấy, biến nạp tế bào động vật Invitrogen (Mỹ) như lipofectamin TM 2000, DMEM, FBS (Biowest), NEAA 100X, PBS 10X Solution (Sigma).
Trang thiết b
Trong q trình nghiên cứu, chúng tơi đã sử dụng các trang thiết bị của Viện Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu hệ gen:
- Tủ lạnh sâu -20oC, -80oC (Sanyo, Nhật Bản), lị vi sóng (Hàn Quốc), pipetman các loại (Gilson, Pháp), cân phân tích (Mettler Toledo 10-4 g, Thụy Sĩ), máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ), máy soi DNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ), máy điện di (PowerPac 300, BioRad, Mỹ), máy PCR (GeneAmp PCR System 9700), máy xác định trình tự ABI PRISM 3100- Genetic Analyzer, box ni cấy vi sinh vật….
2.2. ƣơn p áp
2.2.1. Tách chiết RNA tổng số
Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ tế bào gan dòng JHH5 người được mơ tả chi tiết theo quy trình sau:
Đồng nhất mẫu
Tế bào dịng JHH5 được ni đạt mật độ 106 tế bào và rửa tế bào bằng đệm PBS lạnh, gạn bỏ dung dịch giữ lại tế bào, tiếp tục ủ với dung dịch Trypsin 0,2% trong 2 - 5 phút để tách rời nhau hoàn toàn, bổ sung với 1 ml trizol lắc tròn để tế
bào bị phá vỡ thành dạng dịch phá vỡ tế, chuyển dịch mẫu vào ống Eppendorf 1,5 ml.
Tách pha có chứa RNA
Bổ sung 0,2 ml chloroform, lắc đều trong 15 giây. Để hỗn hợp thu được ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
Hút pha lỏng không màu ở trên cùng sang một ống Eppendorf sạch.
Kết tủa RNA
Bổ sung isopropanol theo tỷ lệ thể tích (1:1), trộn đều và để hỗn hợp trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa RNA.
Rửa RNA
Bổ sung 1 ml ethanol 70%, vortex để rửa RNA.
Ly tâm 7.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, thu RNA và để khơ kết tủa trong khơng khí.
Hịa tan RNA
Bổ sung 50 µl H2O đã được xử lý với DEPC 0,01%. Lắc đều và ủ hỗn hợp trong 10-15 phút ở nhiệt độ phòng.
Kiểm tra chất lƣợng và số lƣợng RNA
Xác định nồng độ RNA dựa trên giá trị OD260.
Điện di biến tính 4 l RNA tổng số để kiểm tra mức độ nguyên v n của RNA
tổng số.
RNA được lưu giữ ở -80oC.
2.2.2. Tổng hợp cDNA
cDNA sợi một được tổng hợp từ khuôn RNA tổng số được tiến hành theo hướng dẫn của Kit tổng hợp cDNA SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Các phân tử RNA thơng tin có đi polyA ở đầu 3’ nên các oligo (dT) sẽ bắt cặp bổ sung với đuôi poly A và dưới sự xúc tác của enzyme SuperScriptTM II Reverse Transcriptase tổng hợp nên các sợi cDNA. Sau cùng,
RNase H sẽ phân hủy tồn bộ RNA khn và sản phẩm thu được sẽ chứa toàn các cDNA sợi đơn được gắn với đuôi oligo (dT) ở đầu 5’.
Phản ứng tổng hợp cDNA được tiến hành trong tổng thể tích 10 µl (0,3 µg RNA tổng số, 1 µl dNTPS 10 mM, 1 µl mồi oligo (dT)12-18 0,5 µg/µl và H2O). Hỗn hợp được ủ ở 65oC trong 5 phút và làm lạnh trong đá trong ít nhất 1 phút.
Bổ sung 9 µl thể tích hỗn hợp (2 µl 10X RT buffer, 4 µl MgCl2 25 mM, 2 µl DTT 0,1 M và 1 µl RNaseOUTTM 40 U/µl) vào hỗn hợp trên và ủ phản ứng ở 42oC trong 2 phút.
Bổ sung 1 µl SuperScriptTM II RT 50U/µl vào hỗn hợp và tiếp tục phản ứng ở 42oC trong 60 phút.
Dừng phản ứng ở 70oC trong 15 phút và làm lạnh nhanh trên đá. Bổ sung 1 µl RNaseH 2 U/µl vào hỗn hợp và ủ ở 37oC trong 30 phút. Giữ mẫu ở -20oC.
2.2.3. Nhân đoạn cDNA bằng phản ứng PCR
ơ sở lý thuyết của PCR
PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp tổng hợp lượng lớn DNA
in vivo trên cơ sở mẫu khn. Q trình tổng hợp DNA kéo dài từ mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và khả năng kéo dài chuỗi của enzyme bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bước: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả sau khoảng 2-3 giờ, lượng DNA sẽ được khuếch đại lên hàng triệu lần.
Quy trình kỹ thuật
Một chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn sau:
Giai đoạn biến tính: DNA mạch kép ban đầu tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt
độ cao (94 – 95oC) trong thời gian ngắn.
Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ thích hợp (khoảng 50 – 60oC), hai mồi là các oligonucleotide dài từ 15 – 30 nucleotide sẽ bám vào hai đầu của đoạn DNA đích theo nguyên tắc bổ sung.
Giai đoạn kéo dài chuỗi: Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng được tăng lên
khoảng 70 - 80oC là nhiệt độ thích hợp để Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi,
tránh hiện tượng kết hợp không đặc hiệu.
Thành phần của phản ứng:
Một mẫu phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 μl gồm có các thành phần sau
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR:
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân cDNA mã hóa cho NQO1 như sau:
2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Sản phẩm DNA (tách chiết từ E. coli, mô, từ phản ứng PCR…) được phân tích định tính nhờ phương pháp điện di trên gel agarose. Agarose là một loại polyme tách từ rong biển, cấu tạo của chúng gồm 2 monome là D-galactose và 3,6-
Thành phần Thể tíc μl
H2O (17,8 – X)
Dung dịch đệm (10x) 2,5 dNTP (2,5 Mm) 2,5 Mồi xuôi (10 pmol) 1,0 Mồi ngược (10 pmol) 1,0
DNA khuôn X
Nguyên tắc
DNA là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường đều có hiệu điện thế và cường độ dịng điện thích hợp, chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương của điện trường với tốc độ tỷ lệ nghịch với kích thước đoạn DNA. Từ đó mà DNA được tách thành các vạch khác nhau trên bản gel.
Nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách. Đoạn DNA có kích thước càng nhỏ địi hỏi hàm lượng gel agarose càng lớn và ngược lại. Bảng 4 cho thấy mối tương quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phân tách các trình tự DNA có kích thước xác định.
Bảng 4. Tương quan giữa nộng độ gel agarose và kích thước đoạn DNA cần phân
tách. àm lƣợng agarose trong gel(%w/v) íc t ƣớc các đoạn DNA cần phân tách (kb) 0,3 5 - 60 0,6 1 - 20 0,7 0,8 - 10 0,9 0,5 - 7 1,2 0,4 - 6 1,5 0,2 - 3 2,0 0,1 - 2
Sau khi điện di xong, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) trong khoảng 10 phút. Các phân tử EtBr có khả năng gắn xen giữa các base của DNA và phát huỳnh quang dưới tách dụng của tia UV, do đó các đoạn DNA sẽ được biểu hiện hiện thành vạch đỏ da cam dưới ánh sáng đèn UV. Để ước lượng kích thước các trình tự DNA trong gel agarose người ta dùng yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (Marker DNA).
ác bƣớc tiến hành
Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cho 0,8 g agarose vào 100 ml đệm TAE 1X, đem
đun trong lị vi sóng cho đến khi agarose tan hồn tồn. Để nguội đến khoảng 60oC thì đổ dung dịch agarose vào khn điện di đã cài lược sẵn. Bề dày gel khoảng 5mm là thích hợp. Sau 30 - 40 phút khi agarose đã được polyme hóa hồn tồn là có thể điện di được.
Tra mẫu DNA vào giếng điện di: DNA được trộn với đệm tra mẫu, sau đó tra vào các giếng trên bản gel. Mẫu DNA được chạy điện di cùng với marker DNA để xác định kích thước phân tử của DNA.
Chạy điện di: Chạy điện di với chương trình: Hiệu điện thế (U = 50 - 100 V), cường độ dòng điện (I = 80 - 100 mA).
Nhuộm DNA: Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra và nhuộm trong dung
dịch EtBr nồng độ 0,5 µg/ml khoảng 10 - 15 phút. Sau đó lấy bản gel ra và rửa bằng cách ngâm trong nước sạch 2 lần, mỗi lần 5-10 phút.
Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại UV254nm, và được chụp ảnh.
2.2.5. Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn
ơ sở lý thuyết
Sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính tại các vị trí xác định nhờ trình tự nhận biết đặc hiệu.
Quy trình
Một phản ứng cắt của enzyme giới hạn thường được tiến hành trong tổng thể tích là 10 µl gồm các thành phần sau: Thành phần Thể tích (µl) H2O 6,5 Đệm 10X của enzyme 1,0 DNA 2,0 Enzyme giới hạn 0,5
Hỗn hợp phản ứng cắt được trộn đều, ủ ở 37oC với thời gian thích hợp tùy từng loại enzyme. Sản phẩm phản ứng cắt được kiểm tra bằng cách điện di trên gel