Các hóa chất, mơi trƣờng và thiết bị thí nghiệm

HƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

HƢƠNG II : NGUYÊN LIỆ UV PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU

2.2. Các hóa chất, mơi trƣờng và thiết bị thí nghiệm

Các loại hóa chất 2.2.1.

Bảng 2: Các loại hóa chất

Hóa chất Hãng sản xuất

Seakem gold Agarose Lonza

Lysostaphin Sigma

Lysozyme Sigma

Proteinase K Sigma

Enzyme SmaI Sigma

Enzyme XbaI Sigma

Tris base Sigma

EDTA Sigma

Phenol Trung Quốc

Chloroform Trung Quốc

Isoamyl alcohol Merck

Ethanol Trung Quốc

Master mix Thermos

Thiết bị thí nghiệm 2.2.2.

Thiết bị Hãng sản xuất (nƣớc)

Bể điện di BIORAD, Mỹ

Bể ổn nhiệt BIORAD, Mỹ

Box cấy vô trùng ESCO, Singapore

Buồng thao tác PCR ESCO, Singapore

ân điện tử Sartorious, ức

Hệ thống chụp ảnh điện di BioDoc-ItTM, Mỹ

Kính hiển vi quang học Olympus, Trung Quốc.

Lị vi sóng Sharp – Malaysia

Máy ly tâm ức

Máy PCR BIORAD, Mỹ

Máy ủ nhiệt lắc rung Eppendorf, ức

Máy voltex Anh

Nồi khử trùng ƣớt Tomy, Nhật Bản

Pipet (pipet man, pipet Pastuer) Pháp

Hệ thống điện di PFGE BIORAD, Mỹ

Tủ ấm, tủ sấy Memmert, ức

Tủ lạnh -20oC Frigor, an Mạch

Tủ lạnh -80oC Frigor, an Mạch

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phân lập các chủng Staphylococcus aureus 2.3.1.

Quá trình phân lập các chủng tụ cầu trong thực phẩm đƣợc tiến hành theo TCVN 4830-1 : 2005 trên môi trƣờng thạch Baird-Parker (BP), sử dụng môi trƣờng pha sẵn theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất, bổ sung dung dịch nhũ tƣơng lòng đỏ trứng 20% và dung dịch Kali tellurite 1%.

Mẫu thức ăn đƣợc hòa tan, pha loãng và cấy trải trên mơi trƣờng thạch BP

hồn chỉnh đến nồng độ thích hợp, ủ 370

C trong 24-48 giờ.

đƣợc thực hiện để khẳng định chắc chắn: phản ứng đông huyết tƣơng, phản ứng tan máu.

 Môi trƣờng cơ bản:

- Sử dụng môi trƣờng bán sẵn, phải theo đúng các chỉ dẫn của nhà sản xuất

- Cách pha: hịa tan 58g trong 0,95 lít nƣớc cất. Khử trùng mơi trƣờng 15 phút

ở 121C

 Dung dịch kali tellurite 1%

- Hịa tan hồn tồn 1g kali tellurite trong 100 ml nƣớc bằng cách đun nóng

rất nhẹ.

- Bột phải dễ tan. Nếu có mặt chất khơng hịa tan màu trắng trong nƣớc thì

loại bỏ bột đó. Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm để khử trùng. Dung dịch có

thể đƣợc bảo quản tối đa một tháng ở nhiệt độ 3o

C ± 2oC.

 Dung dịch nhũ tƣơng lòng đỏ trứng:

- Sử dụng trứng gà tƣơi còn nguyên vẹn. Dùng bàn chải, rửa trứng trong dung

dịch tẩy rửa. Tráng sạch dƣới dạng nƣớc chảy, sau đó khử trùng vỏ bằng cách ngâm trong etanol (70% thể tích) trong 30 giây và để cho đến khô trong khơng khí.

- Tiến hành ở điều kiện vơ trùng, đập vỡ từng quả trứng và tách lỏng ra khỏi

lòng trắng bằng cách chuyển lòng đỏ từ nửa vỏ quả này sang nửa vỏ quả còn lại nhiều lần. ho lịng đỏ vào trong bình vơ trùng và thêm bốn phần thể tích nƣớc vơ trùng. Trộn kỹ. un nóng hỗn hợp này trong nồi cách thủy đặt ở nhiệt độ 47 ° trong 2 giờ và để ở nhiệt độ + 3° ± 2° từ 18 h đến 24 h để tạo kết tủa. Trong điều kiện vơ trùng, thu phần chất lỏng nổi phía trên và bình vơ trùng để sử dụng.

- Dịch nhũ tƣơng này có thể bảo quản ở nhiệt độ + 3° ± 2° tối đa 72 h.

 ách pha mơi trƣờng BP hồn chỉnh:

- Làm tan chảy môi trƣờng cơ bản, sau đó làm nguội trong nồi cách thủy đến

khoảng 47C.

- Dƣới các điều kiện vô trùng, thêm hai dung dịch vào môi trƣờng cơ bản: K2TeO3 : BP theo t lệ 1:100, trứng : BP theo t lệ 5:100.

- Pha theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất

- Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng, pH là 7,4 ± 0,2 ở 25C.

- Khử trùng môi trƣờng 15 phút ở 121oC.

 Phản ứng đông huyết tƣơng

- Chuẩn bị huyết tƣơng thỏ: Sử dụng huyết tƣơng thỏ khơ có bán sẵn và hồi

nƣớc theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất.

- Từ mỗi khuẩn lạc đã chọn, dùng que cấy vô trùng lấy một phần và chuyển

vào ống hoặc lọ đựng môi trƣờng canh thanh não – tim.

- Ủ ở 35°C hoặc 37°C trong 24 ± 2 giờ

- Bằng kỹ thuật vô trùng, lấy 0,1 ml mỗi dịch cấy cho vào 0,3 ml huyết tƣơng

thỏ (trừ khi nhà sản xuất quy định các lƣợng khác) đựng trong các ống hoặc lọ đựng dung dịch hồng cầu vô trùng, và ủ ở nhiệt độ 35°C hoặc 37°C.

- Nghiêng ống, kiểm tra sự kết dính của huyết tƣơng sau khi ủ từ 4 đến 6 giờ

và nếu phép thử là âm tính, thì kiểm tra lại sau khi ủ 24 giờ, hoặc kiểm tra theo thời gian ủ đƣợc nhà sản xuất quy định.

- Nếu thể tích kết dính chiếm hơn một nửa thể tích ban đầu của chất lỏng, thì

phép thử coagulase là dƣơng tính.

- ể kiểm tra âm tính, đối với mỗi mẻ huyết tƣơng, thêm 0,1 ml môi trƣờng

canh thanh não-tim vô trùng vào một lƣợng huyết tƣơng thỏ đã khuyến cáo và ủ nhƣng không cấy. Phép thử hợp lệ khi kiểm tra huyết tƣơng cho thấy khơng có dấu hiệu kết dính.

Tách chiết DNA tổng số 2.3.2.

DN genome của các chủng vi khuẩn đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp đã đƣợc mơ tả trƣớc đó [29], sơ bộ theo các bƣớc nhƣ sau:

- Vi khuẩn đƣợc nuôi trong môi trƣờng canh thang não – tim (BHI) dịch

thể trong thời gian 18-24 giờ, sau đó tế bào đƣợc thu bằng cách ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn tế bào.

- Phá tế bào bằng cách sốc nhiệt từ -20o

C và bể ổn nhiệt 37o , lặp lại 3 lần.

- Bổ sung phenol:chloroform (1:1) với thể tích tƣơng đƣơng, trộn đều và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút tại 4C.

- Thu dịch nổi phía trên sang 1 ống sạch khác, tách chiết với chloroform:

isoamyl alcohol (24:1) bằng cách ly tâm 10000 vòng/phút ở 4oC, 15 phút.

- Thu dịch nổi phía trên cùng sang 1 ống sạch, lặp lại bƣớc trên 1 lần. - Thu dịch nổi, gấp đơi thể tích bằng isopropanol, để yên trong vòng 1

giờ.

- Ly tâm thu kết tủa ở 10000 vòng/ phút, 4oC, 15 phút.

- ổ bỏ phần dịch, rửa kết tủa bằng ethanol 95% lạnh, ly tâm 10000 vòng/phút, 4oC, 15 phút.

- Loại bỏ ethanol, để khơ DN ở nhiệt độ phịng.

- Bổ sung 50µl dung dịch đệm TE, bảo quản ở -20o

C.

P R xác định các gen sinh độc tố ruột của S. aureus 2.3.3.

Phản ứng PCR bao gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính từ DNA dạng sợi kép sang DNA dạng sợi đơn bằng việc

nâng nhiệt độ lên 95oC trong thời gian từ 30 giây đến vài phút.

- Giai đoạn gắn mồi: hai đoạn mồi đặc hiệu sẽ gắn với đoạn DNA tƣơng đồng ở

hai đầu đoạn DNA cần nhân theo nguyên tắc bổ sung khi nhiệt độ đƣợc hạ

xuống thấp hơn nhiệt độ Tm của các đoạn mồi (37-65oC).

- Giai đoạn kéo dài chuỗi: phản ứng tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi

về phía hai đầu 3’ và 5’ của DNA khuôn đƣợc thực hiện ở 72oC nhằm tránh hiện tƣợng gắn không đặc hiệu [47].

Phản ứng P R với các gen coa, sea, seb, sec, sed lần lƣợt mã hóa cho

coagulase và các độc tố ruột SE , SEB, SE , SED của tụ cầu. Trình tự các mồi đƣợc thể hiện ở bảng 2 [62]. Với mỗi phản ứng PCR, thêm vào 12,5µl Master mix, 1µl mồi xi, 1µl mồi ngƣợc, 1µl DN template và bù nƣớc P R sao cho tổng thể tích vừa đủ 25µl. Bộ kit master mix chứa 0,05 U/µl Taq DNA polymerase, 4 mM MgCl, 0,4 mM dNTP mỗi loại (d TP, d TP, dGTP và dTTP). Phản ứng P R các gen độc tố đƣợc thực hiện với chu trình nhiệt: 95º / 10 phút trƣớc khi thực hiện 30 chu kì tiếp theo: 95ºC/ 30 giây, 60ºC/ 45 giây, 72ºC/ 60 giây; và cuối cùng là 72º / 10 phút. Chu

trình nhiệt của phản ứng khuếch đại gen coa: 94º / 2 phút, tiếp theo là 30 chu kì: 95ºC/ 30 giây, 55ºC/ 2 phút, 72º / 4 phút; cuối cùng là 72ºC / 7 phút. Giữ sản phẩm ở 4oC trƣớc khi điện di sản phẩm. iện di sản phẩm P R trên gel agarose 1% có bổ sung RedSafe trong đệm TAE 1x ở 100V, 45 phút.

ác chủng chuẩn sử dụng làm đối chứng cho phản ứng P R:

Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach ( T ® 14458™) Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 19095™) Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach ( T ® 27664™)

Bảng 3. Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR [62]

Gen Trình tự primer (5’3’) Kích thƣớc (bp)

sea GCA GGG AAC AGC TTT AGG C 520

GTT CTG TAG AAG TAT GAA ACA CG

seb GTA TGG TGG TGT AAC TGA GC 163

CCA AAT AGT GAC GAG TTA GG

sec CTT GTA TGT ATG GAG GAA TAA CAA 283

TGC AGG CAT CAT ATC ATA CCA

sed GTG GTG AAA TAG ATA GGA CTG C 384

ATA TGA AGG TGC TCT GTG G

coa GAT AAA GAA GAA ACC AGC AG 987

TGC TTT CGA TTG TTC GAT GC

PFGE xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng 2.3.4.

iện di trƣờng xung điện PFGE các chủng tụ cầu đƣợc thực hiện theo quy trình tham khảo hƣớng dẫn của D - Pulse Net protocol [22]:

Bƣớc 1: Cấy vi khuẩn

Chủng Staphylococcus aureus cấy đ a thạch dinh dƣỡng 5% máu cừu/35-370C,

sau đó lấy 1 khuẩn lạc cấy chuyển tiếp tạo khuẩn lạc thuần (lấy khuẩn lạc tƣơi <18h) Hòa tan trong TE đo OD600 = 1,0 – 1,3 (thể tích cần đo là 500 µl)

Bƣớc 2: Tạo plug

1. Pha Seakem garose 1.2% trong đệm TE. ho vào lị vi sóng làm tan đều

thạch, sau đặt bể nƣớc 650 đến khi dùng. Mỗi plug cần khoảng 200µl thạch.

2. Chuyển 200 µl huyền dịch vi khuẩn vào các tube.

3. Bổ sung 4µl Lysostaphin (1mg/ml) vào hỗn dịch vi khuẩn trên, vortex. 4. Trộn mỗi mẫu với 200 µl thạch- mix bằng pipettet tip, nhỏ vào khuôn tạo plug sau đó để trên đá hoặc để trong tủ lạnh 2 – 8oC trong 10 – 15 phút (Hình 7).

Hình 7. Tạo plug chủng vi khuẩn

5. Dùng thìa mỏng gạt mỗi plug vào mỗi Falcon 15 ml đã có 3 ml dung dịch

EC lysis buffer. Ủ nƣớc 370 /4h (qua đêm)/shaking.

6. Loại đệm, sau đó bổ sung 8 ml TE buffer pH 8, lắc nhẹ 30 phút ở 55oC trên

rotator 150 vòng/ phút. Lặp lại việc rửa plug 3 lần.

7. Loại bỏ đệm TE, cho 1ml dung dịch Proteinase K (1mg/1ml). Ủ qua đêm ở 55oC và lắc nhẹ trên rotator 150 vòng / phút.

8. Loại bỏ đệm Proteinase K solution, rửa bằng 8 ml TE buffer pH 8, lắc 150 vòng/ phút ở 55oC trong 2 giờ. Lặp lại việc rửa plug 3 lần (Hình 8).

9. Cắt plug tạo miếng nhỏ, giữ plug trong 500 µl TE/ 4oC (Hình 9).

Hình 8. Rửa plug bằng đệm

Hình 9. Cắt plug thành các miếng nhỏ

Bƣớc 3: Ủ enzyme giới hạn

Chủng S. aureus thử nghiệm đƣợc cắt bằng SmaI; Chủng chuẩn Salmonella

serotype braendrup strain H9812 cắt bằng XbaI. Ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng 25oC. Thành phần các chất cho mỗi plug trong bƣớc cắt bằng enzyme cắt giới hạn đƣợc cho dƣới bảng sau:

Bảng 4. Thành phần các chất ủ enzyme cắt giới hạn Chủng thử nghiệm Chủng chuẩn Thể tích (µl) Chủng thử nghiệm Chủng chuẩn Thể tích (µl) SmaI XbaI 3 TR4 TR2 15 BSA BSA 1,5 Nƣớc Nƣớc 130,5 Bƣớc 4: Chạy gel 1. huẩn bị 2 lít đệm TBE 0.5%

2. huẩn bị thạch điện di 1% (1,5 g Seakem Agarose pha trong 150 ml TBE 0,5% và làm tan bằng lị vi sóng).

3. Cẩn thận đặt 1 miếng plug lên lƣợc điện di. Nhẹ nhàng thấm hết nƣớc xung quanh miếng plug để miếng plug bám chặt trên lƣợc và tiến hành đổ gel (hình 10). hờ gel đơng trong khoảng 30 phút. Sau đó tiến hành điện di dƣới trƣờng xung với các thông số đƣợc đề cập dƣới đây.

4. ặt chƣơng trình chạy điện di phù hợp (hình 11): voltage density: 6,0V/cm;

Included angle: 1200; Initial Switch Time: 5,0s; Final Switch Time: 40,0s; Run Time: 17 h;

Ramping: Linear;

5. Nhuộm gel trong Ethidium bromide 5% (25 µl Etbr/500 ml TBE 0.5%) ngâm 45 phút. Rửa 3 lần bằng nƣớc, lắc nhẹ trong 10 phút.

6. ọc kết quả và chụp ảnh điện di.

Kết quả điện di trƣờng xung điện đƣợc xử lý bằng phần mềm BioNumerics 6.0.

Hình 10. Hình ảnh mơ tả đổ gel điện di

HƢƠNG III: ẾT QUẢ