Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng
chủng vi sinh vật
Trong mơi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể. Việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% (w/v). Tím kết tinh (crystal violet hay Gentian violet) là một thuốc nhuộm hóa học triarylmethane có cơng thức phân tử là C25H30N3Cl, công thức cấu tạo là [C(C6H4N(CH3)2)3]Cl - Tris (4-(dimethylamino) phenyl) methylium chloride. Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với các tế bào sống, sự thay đổi về cường độ màu thể hiện mức độ và số lượng của các tế bào vi sinh vật.
Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [62] Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật sau khi tách riêng rẽ sẽ được ni cấy kích hoạt trong bình tam giác chứa 10ml môi trường LB lỏng trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào OD620 ở vào khoảng 0,3 - 0,4. Hút 100l dịch nuôi cấy vi khuẩn
bổ sung vào 700l LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC.
Sau 24 giờ, các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 620 nm (OD620) dịch ni cấy vi khuẩn.
Phương pháp quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật:
Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh.
Mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hòa tan trong 1ml etanol 70o. Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm.