Kết quả thu được: 4 chủng có khả năng nhũ tương hóa dầu mạnh nhất là:
Ký hiệu chủng U1.3 A3.3 M3.8 U3.7
Chỉ số nhũ hóa
(%) 74,19 80,58 80,77 67,33
sự gắn kết và phát triển của các vi sinh vật trên một bề mặt. Bởi chúng làm giảm sức căng bề mặt và nhờ đó tăng cường khả năng lan rộng và bám dính của vi sinh vật, hình thành dạng màng nổi hay dạng màng bám dính với bề mặt rắn [71]. Đồng thời, chất hoạt động bề mặt cũng tạo phức với các phân tử kim loại nặng, làm giảm độc tính cho vi sinh vật trong môi trường sống của chúng [81].
3.3.2 Khả năng kháng khuẩn
Kết quả về khả năng tạo màng sinh vật dưới ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, nguồn cacbon, nitơ cũng như khả năng tạo chất hoạt động bề mặt của 8 chủng vi sinh vật phân lập đã giúp chúng tôi đánh giá và lựa chọn ra được 4 chủng có hoạt tính tạo màng sinh vật tốt nhất để tiếp tục thực hiện các nghiên cứu tiếp theo về đánh giá khả năng kháng khuẩn cũng như phân loại các chủng vi sinh vật phân lập cho đề tài nghiên cứu của mình.
Bảng 4: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu Hoạt tính kháng khuẩn (Đường kính vịng kháng khuẩn: mm) Ký hiệu chủng E. coli Vibrio parahaemolyticus Samonella typhi Ralstonia solanacaerum Staphylococcus aureus M3.8 7 9 2 3 2 M4.9 8 10 2 2 2 U1.3 7 9 2 3 3 U3.7 3 2 7 7 8
Kết quả ở bảng 4 cho thấy trong khi các chủng M3.8, M4.9, U1.3 có hoạt tính kháng mạnh đối với E. coli và Vibrio parahaemolyticus thì U3.7 có hoạt tính mạnh đối với 3 chủng Samonella typhi, Ralstonia solanacaerum và Staphylococcus
aureus. Điều này chứng tỏ mỗi chủng vi sinh vật được nghiên cứu có khả năng đối
kháng với một số chủng vi khuẩn gây bệnh nhất định.
Sự phát triển của một mô hình thực vật nhạy cảm với sự nhiễm khuẩn đã chứng minh rằng tác nhân gây bệnh trên cà chua Pseudomonas syringae pv DC3000 có thể được khống chế bởi vi khuẩn B. subtilis thông qua sự tạo thành màng sinh
vật. Bais và cộng sự [70] đã tiến hành nghiên cứu trên rễ cây Arabidopsis bằng cách xử lý với B. subtilis và phân tích bề mặt rễ bằng kính hiển vi quét đồng tiêu laser để khẳng định sự tạo thành một màng sinh vật với cấu trúc không gian ba chiều.
Sự tạo thành màng sinh vật này là một quá trình phức tạp bao gồm sự tiết surfactin, một tác nhân kháng khuẩn có bản chất là một lipopeptit. Chất này hoạt động hiệu quả như một nhân tố kiểm soát sự lây nhiễm của P. syringae trong cây Arabidopsis cũng như quá trình tạo thành màng sinh vật ở bề mặt rễ. Bằng thí nghiệm trên dịng B. subtilis M1 đột biến gen tổng hợp surfactin, dẫn đến sự thiếu hụt trong quá trình sản xuất surfactin đã cho thấy dịng này khơng có khả năng kháng lại sự lây nhiễm của P. syringae và tạo thành màng sinh vật trên bề mặt rễ
P. syringae cũng được xác định trong cả môi trường nuôi cấy dạng dịch và trên bề
mặt thạch.
Nghiên cứu về vai trò của màng sinh vật trong kiểm soát sinh vật dịch bệnh ở cây trồng [5] cũng cho thấy sự tạo thành màng sinh vật trên vùng rễ cây vừa có tác dụng như một bể chứa chất dinh dưỡng cho vùng rễ vừa giúp giảm khả năng lây nhiễm của các mầm bệnh gây hại cho cây trồng.
3.3.3 Đặc điểm hình thái
Để phân loại các chủng phân lập có khả năng tạo thành màng sinh vật mạnh M3.8, M4.9, U1.3, U3.7, chúng tơi quan sát hình dạng khuẩn lạc và nhuộm Gram các chủng, kết quả cho thấy (hình 15):
- Chủng M3.8: Khuẩn lạc trịn, lồi, nhẵn, bóng, màu trắng đục, có diềm xung quanh; đường kính khuẩn lạc 2 - 3 mm, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương.
- Chủng M4.9: Khuẩn lạc trịn, lồi, nhẵn, bóng, màu trắng đục, mọng nước, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương.
- Chủng U1.3: Khuẩn lạc trịn, khơng lồi, màu trắng, hơi xốp, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương.
- Chủng U3.7: Khuẩn lạc tròn, to, màu trắng, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn nheo, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương.
Ký hiệu Hình thái khuẩn lạc Kết quả nhuộm Gram
M3.8
M4.9
U1.3
U3.7
Hình 15. Hình thái khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học (x100)
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử màng sinh vật hình thành từ các chủng vi khuẩn này, chúng tôi nhận thấy các tế bào vi khuẩn có dạng hình que ngắn, nằm
riêng rẽ nhau, không xếp thành chuỗi và có khả năng hình thành mạng lưới liên kết với nhau rất chặt chẽ (hình 16).
M3.8 M4.9
U1.3 U3.7
Hình 16. Hình thái tế bào các chủng vi khuẩn trong màng sinh vật
3.3.4 Phân loại các chủng vi sinh vật phân lập dựa trên gen 16S rDNA
Để xác định phân loại chính xác của các chủng vi khuẩn phân lập M3.8, M4.9, U1.3 và U3.7, chúng tơi tiến hành giải trình tự gen 16S rDNA của chúng.
Kết quả hình 17 cho thấy trình tự gen 16S rDNA của chủng M3.8 tương đồng 99,9% với đoạn 16S của chủng Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng
99,5% với đoạn 16S của chủng Bacillus aerius_AJ831843. Trình tự gen 16S rDNA của chủng M4.9 tương đồng 100% với đoạn 16S của chủng Bacillus licheniformis_X68416; tương đồng 99,6% với đoạn trình tự 16S của chủng Bacillus aerius_AJ831843.
Hình 17. Vị trí phân loại của các chủng M3.8, M4.9 với các lồi có quan hệ họ hàng dựa
vào trình tự gen 16S rDNA
Kết quả hình 18 cho thấy trình tự gen 16S rDNA của chủng U1.3 tương đồng 99,9% với đoạn 16S của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis subsp
spizizenii_AF074970 và tương đồng 99,8% với chủng Bacillus subtilis_AB042061. Trình tự gen 16S rDNA của chủng U3.7 tương đồng 99,8% với đoạn trình tự 16S của vi khuẩn Bacillus velezensis_AY603658 và tương đồng 99,5% với chủng Bacillus nematotocita_AY820954. Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158 Bacillus idriensis_AY904033 100 Bacillus isabeliae_AM503357 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841 100 99 100 Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 M3.8 100 M4.9 80 77 Bacillus sonorensis_AF302118 72 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus velezensis_AY603658 Bacillus nematotocita_AY820954 Bacillus amyloliquefaciens_X60605 59 Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus subtilis subsp subtilis _AB042061 Bacillus subtilis_subsp_spizizenii_ AF074970
Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus mojavensis_AB021191 26 61 59 79 23 69 100 98 100 100 85 100 54 0.01
Hình 18. Vị trí phân loại của chủng U1.3 và U3.7 với các lồi có quan hệ họ hàng dựa vào
trình tự gen 16S rDNA
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng 4 chủng vi khuẩn có khả năng hình thành màng sinh vật mạnh nhất phân lập được từ các khu vực nước thải của các làng nghề đều thuộc chi Bacillus. Chi này bao gồm các vi khuẩn hình que, Gram dương, có
khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ cao, hình thành bào tử và đa số là không gây bệnh. Nhờ khả năng tạo được các sản phẩm thương mại có giá trị, như hầu hết các protease và amylase, cũng như thao tác di truyền dễ dàng mà các vi khuẩn chi
Bacillus được xem là mơ hình nghiên cứu hiệu quả và có tính ứng dụng cao[49].
Sự tạo thành màng sinh vật ở chủng Bacillus subtilis đóng vai trị quan trọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, hóa mỹ phẩm
Staphylococcus aureus_X68417 Bacillus cibi_AY550276 Bacillus indicus_AJ583158 Bacillus idriensis_AY904033 100 Bacillus isabeliae_AM503357 Bacillus safensis_AF234854 Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus altitudinis_AJ831842 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus stratosphericus_AJ831841 99 100 99 Bacillus aerius_AJ831843 Bacillus licheniformis_X68416 Bacillus sonorensis_AF302118 100 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus velezensis_AY603658 U3.7 Bacillus nematotocita_AY820954 82 Bacillus amyloliquefaciens_X60605 79 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus axarquiensis_AY603657 Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus mojavensis_AB021191 78
Bacillus subtilis subsp spizizenii_AF074970
59 U1.3 Bacillus subtilis_AB042061 67 54 79 70 72 100 99 100 98 77 100 66 0.01
[56]. Bằng cách tạo ra hợp chất surfactin trong quá trình tạo màng sinh vật,
B. subtilis giúp các cây trồng có khả năng kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh như Erwina, Pseudomonas, Xanthomonas. Khả năng tạo gramicidin của chủng Bacillus brevis 18-3 có tác dụng làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế
cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora SP-6 [5]. Mặt khác, khả năng tạo chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh vật trong quá trình tạo màng cũng làm tăng mức độ nhũ tương hóa và tạo bọt trong chế biến thực phẩm và tạo nhũ hóa cho các sản phẩm mỹ phẩm [80]. Đồng thời, đặc tính này cũng đã mở ra triển vọng mới trong việc chế tạo chất hoạt động bề mặt sinh học hoạt tính cao từ nguồn vi sinh vật ứng dụng cho cơng nghiệp dầu khí để xử lý các sự cố tràn dầu [6].
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ mẫu 75 chủng vi sinh vật phân lập được từ nước thải các làng nghề ở Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn được 8 chủng M1.10, U1.3, A3.3, M3.8, U3.7, M4.3, M4.9 và M4.10 có hoạt tính tạo màng sinh vật cao hơn các chủng còn lại.
2. Tám chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất ở 37oC và pH từ 7 - 7,5. Trong số các chủng này, bốn chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 có khả năng sinh trưởng và tạo màng sinh vật tốt nhất trong mơi trường khống cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon (fructose, rhamnose, glucosamine) và trong mơi trường khống cơ sở có bổ sung các nguồn nitơ ((NH4)2SO4, cao nấm men) khác nhau.
3. Các chủng M3.8, M4.9 và U1.3 có hoạt tính kháng mạnh đối với E. coli và
Vibrio parahaemolyticus, với đường kính vịng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm và 9
mm; 8 mm và 10 mm; 7 mm và 9 mm; trong khi đó chủng U3.7 có hoạt tính kháng mạnh đối với 3 chủng Staphylococcus aureus, Samonella typhi và Ralstonia solanacaerum với đường kính vịng kháng khuẩn lần lượt là 7 mm, 7 mm và 8 mm.
4. Những phân tích về đặc điểm hình thái và phân tích gen 16S rDNA của 4 chủng cho phép chúng tôi nhận định 4 chủng M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 là vi khuẩn Gram dương thuộc chi Bacillus. Trong đó, chủng M3.8, M4.9 gần với loài Bacillus
licheniformis; chủng U1.3 gần với loài Bacillus subtilis cịn chủng U3.7 gần với lồi Bacillus velezensis.
Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt và đặc tính kháng khuẩn của bốn chủng vi khuẩn phân lập M3.8, M4.9, U1.3, U3.7 để ứng dụng trong công nghệ xử lý nước thải và trong phòng chống dịch hại gây bệnh trên cây trồng.
Tìm hiểu thành phần protein và vai trò của sự điều hòa biểu hiện gen trong quá trình tạo thành màng sinh vật của bốn chủng vi khuẩn phân lập.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt:
1. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2002), Sinh học phân tử, Nxb Giáo dục, Hà Nội.
3. Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học Quốc Gia,
Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh:
4. Allison D. G., Gilbert P., Wilson M. (2000), Community ctructure and co-operation in biofilms, Cambridge University Press, Cambridge, England.
5. Bais H. P., Fall R., Vivanco J. M. (2004), “Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by
biofilm formation and surfactin production”, Plant Physiology, 134(1),
pp. 307-319.
6. Banat I. M. (1995), “Characterization of biosurfactants and their use in pollution removal-state of the art”, Acta biotechnologica, 15, pp. 251-267.
7. Bendinger B., Rijnaarts H. H. M., Altendorf K., Zehnder A. J. B. (1993), “Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids”, Applied and Environmental Microbiology, 59, pp. 3973-3977.
8. Beveridge T. J., Makin S. A., Kadurugamuwa J. L., Li Z. (1997), “Interactions between biofilms and the environment”, FEMS Microbiology Reviews, 20,
pp. 291-303.
9. Boyd A., Chakrabarty A. M. (1994), “Role of alginate lyase in cell detachment of
Pseudomonas aeruginosa”, Applied and Environmental Microbiology, 60,
10. Brading M. G., Jass J., Lappin-Scott H. M. (1995), “Dynamics of bacterial biofilm formation”, Microbial biofilms, Cambridge University Press,
Cambridge, pp. 46-63.
11. Brooks W., Demuth D. R., Gil S., Lamont R. J. (1997), “Identification of a
Streptococcus gordonii SspB domain that mediates adhesion to Porphyromonas gingivalis”, Infection and Immunity, 65, pp. 3753-3758.
12. Characklis W. G. (1990), “Biofilm processes”, Biofilms, Wiley-Interscience,
New York, pp. 195-231.
13. Characklis W. G., Marshall K. C. (1990), “Biofilms: a basis for an interdisciplinary approach”, Biofilms, John Wiley & Sons, New York,
pp. 3-15.
14. Costerton J. W., Geesey G. G., Cheng K. J. (1978), “How bacteria stick”,
Scientific American, 238(1), pp. 86-95.
15. Costerton J. W., Ingram J. M., Cheng K. J. (1974), “Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria”, Bacteriological Reviews, 38(1), pp. 87-110.
16. Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R., Lappin-Scott H. M. (1995), “Microbial biofilms”, Annual Review of Microbiology, 49,
pp. 711-745.
17. Cowan M. M., Warren T. M., Fletcher M. (1991), “Mixed species colonization of solid surfaces in laboratory biofilms”, Biofouling, 3, pp. 23-34.
18. Czaczyk K., Myszka K. (2007), “Biosynthesis of extracellular polymeric substances (EPS) and its role in microbial biofilm formation”, Polish Journal
of Environmental Studies, 16(6), pp. 799-806.
19. Davey M. E., O'toole G. A. (2000), “Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(B),
20. Davies D. G., Parsek M. R., Pearson J. P., Iglewski B. H., Costerton J. W., Greenberg E. P. (1998), “The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm”, Science, 280, pp. 295-298.
21. De Angelis M., Siragusa S., Berloco M., Caputo L., Settanni L., Alfonsi G., Amerio M., Grandi A., Gobbetti M. (2006), “Selection of potential probiotic
lactobacilli from pig feces to be used as additives in pelleted feeding”, Research in Microbiology, 157, pp. 792-801.
22. De Weger L. A., Van Der Vlught C. I. M., Wijfjes A. H. M., Bakker P. A. H. M., Schippers B., Lugtenberg B. (1987), “Flagella of a plant growth- stimulating Pseudomonas fluorescens strain are required for colonization of potato roots”, Journal of Bacteriology, 169, pp. 2769-2773.
23. Decho A. W. (1990), “Microbial exopolymer secretion in ocean environment: Their role(s) in food web and marine process”, Oceanography and Marine Biology: Annual Review, 28, pp. 73-153.
24. Deflaun M. F., Marshall B. M., Kulle E. P., Levy S. B. (1994), “Tn5 insertion mutants of Pseudomonas fluorescens defective in adhesion to soil and
seeds”, Applied and Environmental Microbiology, 60, pp. 2637-2642.
25. Donlan R. M. (2000), “Role of biofilms in antimicrobial resistance”, American
Society for Artificial Internal Organs Journal, 46(6), pp. S47-S52.
26. Donlan R. M. (2002), “Biofilms: Microbial life on surfaces”, Emerging Infectious Diseases, 8(9), pp. 881-890.
27. Donlan R. M., Pipes W. O., Yohe T. L. (1994), “Biofilm formation on cast iron substrata in water distribution systems”, Water Research, 28, pp. 1497-1503. 28. Emerson D., Ghiorse W. C. (1992), “Isolation, cultural maintenance, and
taxonomy of a sheath-forming strain of Leptothrix discophora and
characterization of manganese-oxidizing activity associated with the sheath”,
29. Espinosa-Urgel M., Salido A., Ramos J. L. (2000), “Genetic analysis of functions involved in adhesion of Pseudomonas putida to seeds”, Journal of
Bacteriology, 182, pp. 2363-2369.
30. Fall R., Kinsinger R. F., Wheeler K. A. (2004), “A simple method to isolate biofilm-forming Bacillus subtilis and related species from plant roots”, Systematic and Applied Microbiology, 27, pp. 372-379.
31. Flemming H. C. (1993), “Biofilm and environmental protection”, Water Science
and Technology, 27, pp. 1-10.
32. Fletcher M. (1988), “Attachment of Pseudomonas fluorescens to glass and
influence of electrolytes on bacterium-substratum separation distance”,
Journal of Bacteriology, 170, pp. 2027-2030.
33. Fujita M., Tanaka K., Takahashi H., Amemura A. (1994), “Transcription of the principal sigma-factor genes, rpoD and rpoS, in Pseudomonas aeruginosa is controlled according to the growth phase”, Molecular Microbiology, 13,
pp. 1071-1077.
34. Geesey G. G. (1990), Biofouling and biocorrosion in industrial water systems: Proceedings of the international workshop on industrial biofouling and biocorrosion, stuttg, Springer Verlag, Berlin, Germany.
35. Geesey G. G. (2001), “Bacterial behaviour at surfaces”, Current Opinion in Biotechnology, 4, pp. 296-300.
36. Gilbert P., Das J., Foley I. (1997), “Biofilm susceptibility to antimicrobials”,
Advances in Dental Research, 11(1), pp. 160-167.
37. Haggag W. (2010), “The role of biofilm exopolysaccharides on biocontrol of plant diseases”, Biopolymers, InTech, pp. 217-184.
38. Haggag W. M. (2007), “Colonization of exopolysaccharide-producing
Paenibacillus polymyxa on peanut roots for enhancing resistance against
crown rot disease”, African Journal of Biotechnology, 6(3), pp. 1568-1577. 39. Heukelekian H., Heller A. (1940), “Relation between food concentration and