CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.6.1. Phương pháp điện di SDS-PAGE
Nguyên tắc: Dựa trên quá trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong một dung dịch đặt trong điện trường. Vận tốc dịch chuyển của các phân tử mang điện phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử do đó các phân tử protein khác nhau sẽ có vận tốc dịch chuyển khác nhau, nhờ đó mà có thể phân tách một hỗn hợp các protein.
Bảng 2.1. Thành phần gel chạy điện di protein
STT Hóa chất Running gel 10% Stacking gel 5%
1 Nước cất 3 ml 1.385 ml 2 30% Acrylamide 2.5 ml 0.415 ml 3 1.5M Tris-HCl 1.9 ml (pH 8.8) 0.62 ml (pH 6.8) 4 10% SDS 80 µl 25 µl 5 30% APS 15 µl 7.5 µl 6 TEMED 15 µl 7.5 µl
Chuẩn bị mẫu: Mẫu enzyme được hòa tan trong sample buffer với tỉ lệ 4:1. Lắc đều và gia nhiệt 4 phút ở 100°C. Sau đó ly tâm 10.000 rpm trong 30 giây. Mẫu chuẩn bị xong phải điện di ngay là tốt nhất hoặc để không quá 2 ngày ở 2°C.
Nạp mẫu:
- Mẫu đã chuẩn bị trên được load vào giếng với thể tích thích hợp. Đánh dấu thứ tự các giếng vào sổ để phân biệt được các mẫu. Chạy 120 V. Khi mẫu chạy cách mép dưới của gel còn 0.5 cm nữa thì dừng máy. Lấy gel ra một cách cẩn thận tránh bị rách.
Tiến hành nhuộm gel:
- Nhuộm gel trong 50 ml CBB ở 50°C trong 1 giờ hoặc lâu hơn để CBB bắt
mầu với protein.
- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I ở 50°C trong 30 phút, lặp lại 2 lần mỗi lần 50
ml.
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc tới khi thấy rõ các vạch protein. Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết
quả.