1.5. KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG THỰC TIỄN
1.5.2. Một số ứng dụng của kháng thể đa dòng
Nhƣ đã nói ở trên, kháng thể có tính đặc hiệu rất cao với kháng nguyên tƣơng ứng của nó. Kháng thể có khả năng nhận ra một phân tử protein kháng nguyên trong hơn 108 phân tử protein tƣơng tự nhau. Lợi dụng đặc điểm này, ngƣời ta sử dụng kháng thể đa dịng vào rất nhiều mục đích khác nhau:
1.5.2.1. Sắc kí ái lực
Một kháng nguyên có thể tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực đƣợc chế tạo bằng chính kháng thể kháng kháng nguyên ấy. Kháng thể đƣợc gắn vào giá thể (gel) và nhồi lên cột, sau đó cho hỗn dịch có chứa kháng nguyên chảy qua cột. Kháng nguyên sẽ liên kết một cách đặc hiệu với kháng thể trong khi tất cả các thành phần khác bị đẩy ra. Cuối cùng kháng nguyên sẽ đƣợc thu lại bằng cách sử dụng đệm đẩy có pH 2,5 hoặc >11. ở giá trị pH này, liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể bị phá vỡ. Bằng phƣơng pháp này cũng có thể tinh sạch đƣợc kháng thể từ kháng huyết thanh với cột sắc kí sử dụng kháng nguyên gắn trên giá thể [15].
1.5.2.2. Kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) và hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)
Cả hai kĩ thuật đều có chung một nguyên tắc là dựa trên liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tuy nhiên cách phát hiện liên kết là khác nhau. Kĩ thuật ELISA sử dụng một enzyme gắn với kháng thể, sau khi kháng thể liên kết với kháng nguyên, liên kết này sẽ đƣợc phát hiện bằng cơ chất đặc hiệu của enzyme, có khả năng hiện màu khi tiếp xúc với enzyme. Trong khi đó, kĩ thuật RIA sử dụng phƣơng pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ để phát hiện ra liên kết kháng nguyên - kháng thể. Có nhiều cách đánh dấu đồng vị phóng xạ, phổ biến là sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp 125I. Do đặc điểm, tính phức tạp cũng nhƣ độ chính xác của hai kĩ thuật khác nhau, nên chúng có những ứng dụng khác nhau. Kĩ thuật RIA thƣờng đƣợc dùng để định lƣợng hormon có trong máu hay dịch mô, trong khi kĩ thuật ELISA thƣờng dùng trong chẩn đốn virus, ví dụ nhƣ HIV. Phƣơng pháp “ELISA
bánh kẹp” đƣợc cải tiến từ kĩ thuật ELISA, có thể dùng để phát hiện các sản phẩm tiết, ví dụ nhƣ cytokine.
1.5.2.3. Kĩ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting)
Kĩ thuật này cũng dựa trên nguyên tắc tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên nhƣ kĩ thuật ELISA, nhƣng có nhiều ƣu điểm hơn. Với những protein - kháng nguyên khó tinh sạch, muốn phát hiện, định lƣợng hay xác định khối lƣợng phân tử…ngƣời ta dùng kĩ thuật thẩm tách miễn dịch. Dịch chiết thơ tế bào sau khi xử lí nhiệt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS- PAGE). Các băng protein trên gel đƣợc điện chuyển lên màng lai, sau đó xử lý với kháng thể đặc hiệu protein kháng nguyên quan tâm. Bằng cách sử dụng kháng kháng thể gắn với enzyme có khả năng hiện màu khi có mặt cơ chất, có thể phát hiện cũng nhƣ định lƣợng đƣợc protein quan tâm.
1.5.2.4. Tạo kháng kháng thể (anti- antibody)
Kháng kháng thể đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng kháng thể của một loài nhất định (liên kết đặc hiệu với một kháng nguyên) làm kháng nguyên để gây miễn dịch trên một loài khác. Đặc điểm của kháng kháng thể là có thể liên kết đặc hiệu với tất cả các kháng thể của lồi, vì vậy tránh đƣợc việc phải tạo ra nhiều loại kháng thể đánh dấu để phát hiện ra các kháng nguyên tƣơng ứng. Kháng kháng thể có đánh dấu huỳnh quang hiện nay đƣợc sử dụng rất rộng rãi trong miễn dịch học và nhiều lĩnh vực khác của sinh học nhƣ là một nhân tố thứ cấp cho việc phát hiện kháng thể cần quan tâm, ví dụ nhƣ để xác định các cấu trúc trong tế bào, hay hỗ trợ trong kĩ thuật RIA và ELISA với những kháng thể không thể đánh dấu [15].
Một cải tiến trong việc phát hiện các kháng thể quan tâm là lợi dụng những protein vi khuẩn có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng thể. Một trong số những protein sử dụng phổ biến là protein A, một loại protein vỏ của vi khuẩn Staphylococcus
aureus, đƣợc dùng rất nhiều trong tinh sạch kháng thể IgA, IgG... [15].
Để chọn lọc một gen từ ngân hàng gen, ngoài các phƣơng pháp lai DNA, RNA, cịn có thể sử dụng phƣơng pháp kháng ngun - kháng thể. Dùng sản phẩm protein của gen để tạo ra kháng thể đặc hiệu, sau đó dùng chính kháng thể này để phát hiện ra tế bào biểu hiện mang vector có chứa cDNA từ ngân hàng gen. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rất phổ biến trong chọn lọc các gen mã hoá protein bề mặt tế bào từ ngân hàng gen [15].
Dựa trên nguyên tắc liên kết đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể ngƣời ta cũng có thể xác định đƣợc sản phẩm protein chƣa biết của một gen nhân dịng. Từ trình tự nucleotit đã biết của gen, một đoạn peptit đƣợc tổng hợp và sử dụng để gây miễn dịch, tạo kháng thể đặc hiệu. Kháng thể kháng peptit này sau đó có thể sử dụng để phát hiện các sản phẩm protein của gen, cũng nhƣ có thể tìm hiểu sự phân bố hay chức năng của protein này trong tế bào và mô [15].
Những ứng dụng nêu trên chỉ là một trong số những ứng dụng chính của kháng thể đa dịng, ngồi ra cịn rất nhiều các ứng dụng khác trong y học cũng nhƣ trong nghiên cứu sinh học. Mỗi phƣơng pháp, kĩ thuật có những ƣu, nhƣợc điểm riêng nhƣng đều có chung một nguyên tắc là dựa trên tính liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể.
CHƢƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP