Mẫu (>1 kg) được cắt nhỏ ra, lấy khoảng 200 g mẫu đại diện và đồng nhất bằng thiết bị đồng nhất mẫu
Chuyển 10 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL
Thêm 10 mL ACN +1g Na3C6H5O7 .1,5 H2O + 1 g NaCl + 0,5 g Na2C6H6O7. 2H2O +4 g MgSO4
Lắc mạnh trong khoảng 2-3 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vịng/phút và trong 5 phút
Chuyển 4 mL vào ống ly tâm 15 mL trong đó đã có 100 mg MgSO4+30 mg PSA/mL dịch chiết và lắc trong khoảng 30 giây
Ly tâm 3000 vòng/phút trong khoảng 5 phút
Chuyển 2 mL dịch chiết vào vial 2 mL và thêm 5% axit focmic và lắc đều
Việc đồng nhất mẫu nhằm mục đích tăng diện tích bề mặt, thuận lợi cho quá trình tách chiết. Trong quá trình này sinh ra nhiệt có thể làm mất đi HCBVTV, ảnh hưởng đến kết quả phân tích, nên mẫu được đồng nhất trong điều kiện đông lạnh (vừa rã đông).
Sử dụng dung môi axetonitril trong phương pháp QuEChERS bởi vì nó có nhiều đặc điểm thuận lợi nhất cho việc tách chiết ở phạm vi rộng nhất các HCBVTV. Chẳng hạn như so sánh với dung mơi axeton hay etylaxetat thì khi thêm hỗn hợp muối, dung môi và nước dễ dàng tách khỏi nhau hơn là axeton. Etylaxetat có thể hịa trộn một phần với nước nhưng lại chiết luôn cả chất béo và sáp từ nền mẫu, cho độ thu hồi thấp đối với hóa chất trừ sâu ở dạng axit, bazơ. Dung môi ACN chiết không tốt với các chất dễ tan trong mỡ, nhưng với những mẫu có hàm lượng đường cao thì ACN và nước dễ dàng hình thành hai pha để chiết các hoạt chất trong HCBVTV lên pha hữu cơ. So với axeton thì ACN dễ loại nước hơn khi thêm MgSO4. Dung mơi ACN thích hợp cho cả sắc ký lỏng và sắc ký khí. Do vậy trong phương pháp QuEChERS lựa chọn dung môi ACN để chiết các hoạt chất BVTV. Tuy nhiên dung mơi này có một nhược điểm là khó bay hơi hơn nên thời gian cô quay làm giàu mẫu sẽ lâu hơn.
Muối và hệ đệm thêm vào để cân bằng pH của dung dịch, bảo vệ chất phân tích.
MgSO4 tạo điều kiện khắc nghiệt để HCBVTV khơng liên kết được vào cơ chất với q trình sinh nhiệt mạnh.
Trước đây bước làm sạch thực hiện dựa trên việc nhồi chất hấp thụ lên cột sắc ký. Nhưng trong phương pháp này, phần dung dịch chiết được cho vào ống nhỏ có chứa một lượng nhỏ PSA (amin bậc 2), lắc đều sau đó ly tâm để tách phần dung dịch và chất rắn hấp thu. Chất hấp thu chỉ giữ lại thành phần nền mẫu, không giữ các HCBVTV. Trong trường hợp mẫu chứa nhiều chất béo thì thêm bột C18 vào để loại các chất béo, mẫu chứa nhiều chất màu trong thực vật thì thêm cacbon hoạt tính GCB.Cách làm sạch này so với chiết SPE thì dễ thực hiện hơn, khơng phải hoạt hóa cột, và dùng ít dung mơi.
Sau khi tiếp xúc với PSA, pH của dung dịch chiết tăng lên đến giá trị >8, do đó ảnh hưởng đến sự ổn định của HCBVTV. Nếu dung dịch chiết suất được axít hóa xuống pH = 5 thì chất sẽ ổn định hơn và có thể lưu giữ trong vài ngày. Ngồi ra, axit focmic cịn có tác dụng đẩy HCBVTV ra khỏi cơ chất thực vật, tăng hiệu quả cho phân tích.
2.2.4. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Sắc ký khí (Gas Chromatography – GC) là phương pháp tách chất trong đó pha động là chất khí (được gọi là khí mang) và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn hoặc chất lỏng phủ trên bề mặt chất mang trơ dạng rắn hay phủ đều lên thành phía trong cột.
Nhờ có khí mang từ bom khí (hoặc máy sinh khí), mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại đây nồng độ chất được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hay máy vi tính. Các tín hiệu được xử lí tại đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả. Kết quả của q trình phân tích sắc ký khí được biểu diễn bằng sắc đồ. Trên sắc đồ nhận được, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic. Mỗi pic của sắc đồ thường ứng với một chất hoặc một nhóm chất trong mẫu phân tích.
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là một phương pháp phân tích cơng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Phương pháp này đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) hoặc bằng Dalton. 1amu = 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro.
Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hóa phân tử trung hịa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phân tử mang năng lượng cao theo sơ đồ:
ABCD + e → ABCD+ + 2e (>95%) ABCD + e → ABCD2+ + 3e
ABCD + e → ABCD-
Phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích ABCD + e* → ABn+ + C + Dm-