2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Sau khi phân tích trên hệ thống GC/MS, sử dụng phần mềm định lượng để đưa ra kết quả dựa vào đường chuẩn, áp dụng phương pháp tốn thống kê với các thơng số đặc trưng như sau:
Giá trị nồng độ trung bình ( ̅) của dãy n mẫu lặp lại:
̅ ∑
Độ lệch chuẩn (SD):
√∑ ̅̅̅
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) được dùng để biểu diễn sai lệch dữ liệu (độ chụm) một cách khách quan và được xác định bằng cách lấy độ lệch chuẩn (SD) chia cho giá trị trung bình:
̅
Giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện được xác định theo công thức LOQ = 3LOD
Trong đó
xi: Nồng độ của dãy mẫu lặp lại
̅: Nồng độ trung bình của dãy mẫu lặp lại
n: Số lần lặp lại
LOD: Giới hạn phát hiện LOQ: Giới hạn định lượng
b: Hệ số góc của phương trình hồi qui nhận được từ đường chuẩn
2.2.6. Phương pháp đánh giá rủi ro sức khỏe con người
Việc đánh giá rủi ro đối với sức khỏe con người thông thường được thực hiện qua việc so sánh mức độ phơi nhiễm đối với dân cư đang bị phơi nhiễm hoặc có nguy cơ bị phơi nhiễm ở mức độ phơi nhiễm chưa gây độc [25,27].
Đánh giá rủi ro sức khỏe là phương pháp để cung cấp thông tin về tác dụng gây ung thư cho những người tiêu thụ [25,27].
Đánh giá rủi ro sức khỏe đối với con người khi tiêu thụ thực phẩm theo công thức sau:
HQx = ∑ = HIx cải bẹ + HIx cải canh + HIx cải ngồng + HIx cải thìa + HIx quả đỗ + HIx dƣa chuột + HIx đậu bắp + HIx cà chua
HIx = CDI/RfD
CDI = (Cx x IR x EF x ED) / (BW x AT)
Trong đó:
HIx: Hệ số rủi ro của hoạt chất x
CDI: Liều tiếp nhận hàng ngày lâu dài (mg/kg/ngày) RfD: Liều tham chiếu (mg/kg/ngày)
Cx: Nồng độ hoạt chất trong rau (mg/kg) IR: Lượng rau ăn vào trong 1 ngày (kg/ngày) EF: Tần suất phơi nhiễm (ngày/năm)
ED: Khoảng thời gian phơi nhiễm (30 năm với người trưởng thành) BW: Trọng lượng cơ thể (kg)
AT: Thời gian phơi nhiễm trung bình (ngày)
Giá trị RfD của λ – Cyhalothrin, Permethrin, Cypermethrin và Deltamethrin qua đường miệng lần lượt là 0,005; 0,05; 0,01; 0,01 mg/kg/ngày [21, 22, 23, 24].
HQ <1: Khơng ảnh hưởng gì
HQ >=1: Chất có khả năng gây ảnh hưởng bất lợi đến sức khỏe khi bị phơi nhiễm.
2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất Thiết bị và dụng cụ Thiết bị và dụng cụ
- Máy sắc ký khí khối phổ GC/MS 7890B (Agilent) - Cân phân tích 0,001 g
- Máy nghiền mẫu - Máy ly tâm - Máy siêu âm
- Bình định mức dung tích 10 mL±0,04; 20 mL±0,04; 50 mL±0,06 - Ống đong dung tích 1000 mL
- Ống ly tâm, có nắp xốy dung tích 15 mL, 50 mL - Pipet loại 1 mL±0,01; 2 mL±0,01; 10 mL±0,05 - Micropipet 50-200 μL
- Ống đựng mẫu chiết 2,0 mL
Hóa chất
- Chất chuẩn λ-cyhalothrin, permethrin, cypermethrin, deltamethrin (sigma aldrich, Mỹ), nồng độ 1000ppm.
- Axit focmic
- Acetonitril, tinh khiết HPLC - Natri clorua (NaCl)
- Magie sulphat heptahydrate (MgSO4.7H2O) (nung 550oC trong 8 giờ, để nguội, cho vào bình đậy kín, bảo quản trong binh hút ẩm)
- Natri hydrogencitrate (C6H5Na2O7.1.5H2O) - Tri natri citrate dehydrate (C6H5Na3O7.2H2O) - Amoni acetat (CH3COONH4)
- Primary secondary amine (PSA) kích thước hạt 40-60 µm
Pha dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 µg/mL. - Dung dịch chuẩn trung gian nồng độ 10 µg/mL.
Dùng micropipette lấy 200 µL đung dịch chuẩn gốc 1000 µg/mL cho vào bình định mức dung tích 20 mL, thêm dung mơi ACN đến vạch và lắc đều.
- Dung dịch chuẩn làm việc.
Pha loãng liên tục dung dịch chuẩn trung gian thành dãy chuẩn làm việc có nồng độ là 50ng/mL; 100ng/mL; 500 ng/mL; 1000ng/mL bằng dung môi ACN.
Điều kiện phân tích trên GC/MS
Bảng 2.1: Chƣơng trình GC/MS
Khí mang Khí He, 99,99%
Tốc độ khí mang 1mL/phút
Chương trình nhiệt độ
80˚C giữ 1 phút, tăng 40˚C/phút lên 160˚C giữ 1 phút, tăng 3˚C/phút đến 250˚C giữ 2 phút, tăng 40˚C/phút đến 280˚C giữ 10 phút, tăng 40˚C/phút lên 300˚C giữ 1 phút.
Nhiệt độ buồng tiêm mẫu 250˚C Thể tích bơm mẫu 1 µl
Hình 2.3: Phổ khối lƣợng của hỗn hợp 4 chất nghiên cứu
Thời gian lưu của λ-cyhalothrin, deltamethrin, cypermethrin, permethrin lần lượt là 30,710 phút; 33,125 phút; 34,891 phút; 37,734 phút.
2.4. Lấy mẫu
Đặc điểm khu vực nghiên cứu
Hà Nam có điều kiện thời tiết, khí hậu mang đặc trưng của khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm ướt, với hai hướng gió chủ đạo Đơng Bắc và Đơng Nam, có 4 mùa với 4 kiểu thời tiết: mùa xuân ấm áp, mùa Hè nóng, mùa Thu mát mẻ và mùa Đơng lạnh.
Nhiệt độ trung bình hàng năm vào khoảng 23-24oC, số giờ nắng trung bình khoảng 1300-1500giờ/năm.Trong năm thường có 8-9 tháng có nhiệt độ trung bình trên 20oC (trong đó có 5 tháng có nhiệt độ trung bình trên 25oC) và chỉ có 3 tháng nhiệt độ trung bình dưói 20oC, nhưng khơng có tháng nào nhiệt độ dưới 16oC. Hai mùa chính trong năm (mùa hạ, mùa đơng) với các hướng gió thịnh hành: về mùa hạ gió nam, tây nam và đơng nam; mùa đơng gió bắc, đơng và đơng bắc.
Độ ẩm trung bình hàng năm là 85%, khơng có tháng nào có độ ẩm trung bình dưới 77%. Tháng có độ ẩm trung bình cao nhất trong năm là tháng 3 (95,5%), tháng có độ ẩm trung bình thấp nhất trong năm là tháng 11 (82,5%). Nhìn chung độ ẩm khơng khí trung bình hàng năm khu vực Hà Nam tương đối lớn, dao động từ 81,5 – 84%. Diễn biến độ ẩm phụ thuộc vào lượng mưa nên trong 1 năm thường có 2 thời kỳ, một thời kỳ độ ẩm cao và một thời kỳ độ ẩm thấp.
Tốc độ gió và hướng gió :Mùa đơng có gió hướng bắc và đơng bắc từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Mùa hè có gió Nam và Đơng Nam từ tháng 4 đến tháng 8. Khu vực Hà Nam chịu ảnh hưởng của bão tương tự như vùng đồng bằng Bắc Bộ. Trong những năm gần đây số lượng cơn bão ảnh hưởng đến tỉnh ta khơng nhiều, tuy nhiên đang có chiều hướng tăng lên do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu trên trái đất.Tốc độ gió trung bình trong năm: 2,5 m/s.
Các hiện tượng khí tượng bất thường: Ở đồng bằng Bắc Bộ có những khu vực xảy ra hiện tượng mưa đá, vịi rồng, gió lốc... tuy nhiên ở tỉnh Hà Nam hiện tượng này ít xảy ra.
Lượng mưa trung bình khoảng 1900mm, năm có lượng mưa cao nhất tới 3176mm (năm 1994), năm có lượng mưa thấp nhất cũng là 1260 mm (năm 2015). Lượng mưa trung bình trong 8 năm gần đây khoảng 1.738,9 mm/năm, chia ra hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khô. Mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10 chiếm khoảng 80% lượng mưa cả năm, tập trung các tháng 5, 6, 7, 8, 9,10. Mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau.
Khí hậu có sự phân hóa theo chế độ nhiệt với hai mùa tương phản nhau là mùa hạ và mùa đông cùng với hai thời kỳ chuyển tiếp tương đối là mùa xuân và mùa thu. Mùa hạ thường kéo dài từ tháng 5 đến tháng 9, mùa đông thường kéo dài từ giữa tháng 11 đến giữa tháng 3; mùa xuân thường kéo dài từ giữa tháng 3 đến hết tháng 4 và mùa thu thường kéo dài từ tháng 10 đến giữa tháng 11.
Hà Nam có lượng mưa trung bình cho khối lượng tài nguyên nước vào khoảng 1,602 tỷ m3. Dịng chảy mặt từ sơng Hồng, sông Đáy, sông Nhuệ hàng năm đưa vào lãnh thổ khoảng 14,050 tỷ m3 nước. Dòng chảy ngầm chuyển qua lãnh thổ cũng giúp cho Hà Nam luôn luôn được bổ sung nước ngầm từ các vùng khác. Nước ngầm ở Hà Nam tồn tại trong nhiều tầng và chất lượng tốt, đủ đáp ứng cho nhu cầu phát triển kinh tế-xã hội.
Điều kiện khí hậu, thủy văn trên đây rất thuận lợi cho phát triển một nền nông nghiệp sinh thái đa dạng, với nhiều loại động thực vật nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới. Mùa hạ có nắng và mưa nhiều, nhiệt độ và độ ẩm cao, thích hợp với các loại
vật ni cây trồng nhiệt đới, các loại cây vụ đơng có giá trị hàng hóa cao và xuất khẩu như cà chua, dưa chuột,…[12].
Sản xuất nông nghiệp từng bước phát triển theo hướng cơng nghiệp hóa, sản xuất sản phẩm sạch ứng dụng cơng nghệ cao.
Đến nay tỉnh đã có một số doanh nghiệp có tiềm lực tài chính, kinh nghiệm sản xuất tham gia sản xuất tại tỉnh như Công ty VinEco của Tập đoàn VinGroup, Công ty Cổ phần Đầu tư và phát triển nông nghiệp công nghệ cao Hà Nam...
Đến nay đã tích tụ được 225 ha đất nơng nghiệp trong 4 khu quy hoạch, giao cho các doanh nghiệp tổ chức sản xuất 221,46 ha [10].
Địa điểm lấy mẫu:
Tiến hành lấy mẫu tại 3 hợp tác xã trồng rau sạch, tại 2 cửa hàng rau sạch và tại 2 chợ. Cụ thể như sau:
Bảng 2.2: Địa điểm lấy mẫu
STT Địa điểm Ký hiệu
mẫu Ghi chú
1 HTX NN Hạ Vỹ ĐĐ1
Địa chỉ: Xóm 5, Hạ Vỹ, xã Nhân Chính, huyện Lý Nhân, tỉnh Hà Nam
Quy mơ 28 hộ, diện tích 100,000 m2
2 Cửa hàng thực
phẩm Green Food ĐĐ2 Địa chỉ: Đường Lê Công Thanh, TP Phủ Lý, tỉnh Hà Nam.
3 Chợ Vĩnh Trụ ĐĐ3 Địa chỉ: Thị trấn Vĩnh Trụ, huyện Lý Nhân, tỉnh Hà Nam.
4 HTX Dịch vụ NN
Thanh Sơn ĐĐ4
Địa chỉ: Xóm 5, xã Thanh Sơn, huyện Kim Bảng, tỉnh Hà Nam
Quy mơ 11 hộ, diện tích 50,000 m2
5 HTX Nông sản
hữu cơ Phù Vân ĐĐ5
Địa chỉ: Thôn 4, xã Phù Vân, TP Phủ Lý, tỉnh Hà Nam
Quy mơ 8 hộ, diện tích 3,5 ha.
Nguyễn Thị Giang Phủ Lý, tỉnh Hà Nam.
7 Chợ Bầu – Phủ Lý ĐĐ7 Địa chỉ: Phường Lương Khánh Thiện, TP Phủ Lý, tỉnh Hà Nam.
Các loại rau trồng tại các hợp tác xã này thường theo vụ mùa. Mỗi cửa hàng rau sạch sẽ đăng ký lấy nguồn cung từ một hợp tác xã trồng rau sạch trên địa phương. Cụ thể, cửa hàng thực phẩm Green Food lấy nguồn cung từ HTX NN Hạ Vỹ, cửa hàng rau sạch Nguyễn Thị Giang lấy nguồn cung từ HTX Nông sản Hữu cơ Phù Vân. Để thấy sự khác biệt về dư lượng HCBVTV trong rau quả tại các địa điểm, tiến hành lấy mẫu theo khu vực. Tại mỗi khu vực, các mẫu được lấy từ một HTX trồng rau sạch, một cửa hàng cung cấp rau sạch và một chợ. Tại huyện Lý Nhân, các mẫu được lấy từ HTX NN Hạ Vỹ, cửa hàng thực phẩm Green Food và chợ Vĩnh Trụ. Tại TP Phủ Lý, các mẫu được lấy từ HTX Nông sản Hữu cơ Phù Vân, cửa hàng rau sạch Nguyễn Thị Giang và chợ Bầu. Chợ Vĩnh Trụ và chợ Bầu là hai chợ lớn thuộc hai khu vực này, họp chợ hàng ngày, đa dạng các loại thực phẩm, nguồn cung từ các hộ nông dân nhỏ lẻ và hầu như khơng có nguồn từ các hợp tác xã trồng rau sạch.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá dƣ lƣợng HCBVTV nhóm pyrethroid trong một số loại rau quả
3.1.1. Đánh giá phương pháp
3.1.1.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn
Lập đường chuẩn là một trong những yêu cầu đầu tiên của phương pháp phân tích. Từ khoảng tuyến tính của đường chuẩn cho biết khoảng nồng độ chất phù hợp sử dụng trong phân tích trên GC/MS. Các dung dịch sử dụng để dựng đường chuẩn được pha từ các dung dịch chuẩn gốc bằng acetonitril. Mỗi dung dịch chuẩn được bơm trên hệ GC/MS 3 lần, diện tích pic trung bình của 3 lần phân tích sẽ là số liệu sử dụng để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ.
Bảng 3.1: Nồng độ và diện tích pic trung bình của các chất chuẩn
Nồng độ (ng/mL)
Số đếm diện tích pic
λ - Cyhalothrin Permethrin Cypermethrin Deltamethrin
50 962 938 3057 726
100 2486 4021 4312 2895
500 14603 31122 14284 19054
1000 30243 68126 26826 41292
Bảng 3.2: Phƣơng trình đƣờng chuẩn của các chất chuẩn
Tên hoạt chất Công thức bậc nhất Hệ số tương quan R2 λ - Cyhalothrin y = 30,13*x – 536,30 0,9999
Permethrin y = 65,71*x – 2388,97 0,9997
Cypermethrin y = 25,00*x + 1808,02 0,9999
Deltamethrin y = 41,19*x – 1306,82 0,9999
Trong thiết bị phân tích, phần mềm Agilent-Mass Hunter B1.0 giúp lập đường chuẩn tự động.
Kết quả phân tích cho thấy:
Phương trình hồi quy của λ - Cyhalothrin là y = 30,13*x – 536,30 hệ số tương quan R2 = 0,9999.
Phương trình hồi quy của Permethrin là y = 65,71*x – 2388,97, hệ số tương quan R2 = 0,9997
Phương trình hồi quy của Cypermethrin là y = 25,00*x + 1808,02, hệ số
tương quan R2
= 0,9999
Phương trình hồi quy của Deltamethrin là y = 41,19*x – 1306,82, hệ số
tương quan R2 = 0,9999
Các đường chuẩn của 4 hoạt chất này đều có hệ số tương quan tuyến tính cao hơn 0,999.
3.1.1.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện được nhưng không sử dụng để định lượng.
Giới hạn định lượng LOQ là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể định lượng được với độ chụm và chấp nhận được trong điều kiện tiến hành phân tích.
Tại các phịng thí nghiệm khác nhau thì giá trị LOD và LOQ nhận được là khác nhau mặc dù áp dụng cùng một phương pháp phân tích. Các giá trị này phụ thuộc điều kiện vận hành thiết bị (nhiệt độ, áp suất, điện áp,…), phương pháp phân tích (xử lý mẫu, nhiễm bẩn mẫu,…), tay nghề của nhân viên, chất lượng của hóa chất. Xác định giới hạn phát hiện dựa trên mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn, mẫu trắng là mẫu khơng chứa hoạt chất cần phân tích. Thêm một lượng chất chuẩn đã biết trước nồng độ vào mẫu trắng sao cho tỷ lệ tín hiệu chất phân tích và nhiễu đường nền trong khoảng từ 3 đến 10 và thực hiện lặp lại 10 lần sau đó tính LOD theo cơng thức đã nêu ở mục 2.2.4.
Để xác định ̅ và SD, tiến hành n thí nghiệm để xác định các kết quả đo nồng độ chất trong các mẫu trắng thêm chuẩn, từ đó thu được các giá trị nồng độ mỗi lần phân tích là xi (i từ 1 đến n). Từ đó tính được các giá trị LOD và LOQ của phương pháp phân tích.
Tiến hành phân tích 10 mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 50 ng/mL. Kết quả phân tích thu được sử dụng để tính tốn giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các chất của phương pháp phân tích, cụ thể trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng
Đơn vị: ng/mL
λ -
Cyhalothrin Permethrin Cypermethrin Deltamethrin
Giá trị 50,4 50,5 50,0 50,3 48,6 50,9 51,1 50,4 48,0 50,5 50,2 50,4 47,6 50,1 51,8 49,8 47,7 49,2 50,0 50,3 47,5 48,4 50,4 51,1 51,1 49,1 51,5 49,8 47,5 50,2 50,6 49,2 47,9 48,7 50,0 50,4 47,6 50,0 50,3 50,7 Giá trị trung bình (TB) 48,39 49,75 50,59 50,24 SD 1,30 0,84 0,65 0,53 LOD 3,66 2,37 1,84 1,49 LOQ 10,97 7,11 5,55 4,46
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của λ – Cyhalothrin tương ứng là 3,66 và 10,97 ng/mL; giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của Permethrin tương ứng là 2,37 ng/mL và 7,11 ng/mL; giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của Cypermethrin tương ứng là 1,84 ng/mL và 5,55 ng/mL; giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của Deltamethrin tương ứng là 1,49 ng/mL và 4,46 ng/mL.
3.1.1.3. Độ thu hồi độ lặp lại
Tiến hành quy trình phân tích các chát nghiên cứu trên nền mẫu dưa chuột có cho thêm chuẩn với 2 nồng độ là 200ng/mL và 500ng/mL, tại mỗi mức nồng độ phân tích lặp lại 5 lần, tính hiệu suất thu hồi và độ lặp lại của các lần phân tích.
Bảng 3.4: Độ thu hồi và độ lặp lại của λ – Cyhalothrin
Lặp lại Hoạt chất Mức thêm chuẩn 200 ng/mL Độ thu hồi (%) Mức thêm chuẩn 500 ng/mL Độ thu hồi (%) 1 λ – Cyhalothrin 181,3 90,7 485,6 97,1 2 192,5 96,3 495,9 99,2 3 187,8 93,9 501,4 100,3