CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. Tình hình nghiên cứu về phơi vơ tính, rễ bất địn hở một số loài thuộc các ch
chi quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae)
1.2.1. Chi Panax
1.2.1.1. Phơi vơ tính
Qua sử dụng phơi hợp tử non Panax ginseng, Arya và cộng sự (1993) đã nghiên cứu sự hình thành phơi vơ tính và mơ sẹo có khả năng sinh phôi. Các phôi sơ cấp đã tạo phôi thứ cấp cấp 1, cấp 2 và sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST). Một số loại auxin được sử dụng như 2,4-D, NAA và IAA 1 mg/L rất thích hợp cho tạo phơi thứ cấp; ngược lại, kinetin, BA ức chế tạo phôi thứ cấp [34].
Choi và cộng sự (2003) đã sử dụng các mảnh lá mầm phôi hợp tử sâm Panax
ginseng tạo phơi vơ tính trực tiếp trên môi trường đặc MS không bổ sung chất ĐHST, có 30 g/L đường; ngược lại, mơi trường có nồng độ khống NH4NO3 cao (60
mM) chỉ cảm ứng tạo mơ sẹo có khả năng sinh phơi. Mơ sẹo có khả năng sinh phơi được cấy chuyển nhiều lần trên mơi trường vẫn có khả năng phát triển tiếp tục dù không bổ sung chất ĐHST. Mơ sẹo được ni cấy trong bình tam giác (V500 mL) chứa mơi trường MS/½MS có 30 g/L đường để nhân lên phục vụ cho nuôi cấy quy mô lớn hơn trong bioreactor (V20 lít); khối lượng tươi mơ tăng lên 7,1 lần sau 5 tuần nuôi cấy trong bioreactor chứa mơi trường 1/3MS có 30 g/L đường. Hàm lượng ginsenoside tổng số thấp hơn 6 lần so với rễ cây sâm sinh trưởng ở điều kiện tự nhiên [35].
Cũng từ vật liệu mảnh lá mầm phôi hợp tử, Zhou và Brown (2006) đã xây dựng được quy trình tạo cây sâm Bắc Mỹ (Panax quinquefolius) có hiệu quả thơng qua ni cấy tạo phơi vơ tính. Tiền xử lý mảnh lá mầm với 1 M đường ở 4oC đã cải thiện được số lượng phơi hình thành. Việc kết hợp tiền xử lý với nuôi cấy dùng nồng độ đường cao (7%) cũng đã nâng cao được tỷ lệ phát sinh phôi từ 40% lên 75%, số lượng phôi/mẫu cấy từ 10 lên 21. Tỷ lệ hình thành phơi thứ cấp đạt 90% khi mơ phơi vơ tính sơ cấp được ni cấy trên mơi trường MS có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L NAA. Phơi phát triển đến giai đoạn trưởng thành (trong đó có ½ lượng phơi nẩy chồi) trên
mơi trường SH có 1% than hoạt tính và 85% phơi phát triển thành cây con (đầy đủ rễ thân và lá) khi được ni cấy trên mơi trường ½SH có 0,5% than hoạt tính. Cây con có kiểu hình bình thường ở giai đoạn ex vitro [36].
Nghiên cứu của Kim và cộng sự (2012) đã thiết lập hệ thống tái sinh phơi vơ tính thứ cấp Panax ginseng trực tiếp từ phơi vơ tính sơ cấp, ni cấy trên môi trường MS không bổ sung chất ĐHST. Môi trường EM (1/3MS, với ½ lượng NH4NO3 và KNO3, có 20 - 30 g/L sucrose) tạo điều kiện thích hợp cho sự phát triển của phôi thứ cấp đến giai đoạn cây con. Cây con có rễ cọc hồn chỉnh khi được ni cấy trên mơi trường ½SH có 0,5% than hoạt tính. Tần suất cao của hệ thống tái sinh này thơng qua q trình phát sinh phơi thứ cấp theo chu kỳ (cyclic manner). Sự tăng sinh liên tục của phơi vơ tính thơng qua tạo phơi thứ cấp, nên rất hữu ích cho nhân giống.[37].
Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào (LMTB) đã được sử dụng trong tạo phôi trực tiếp từ một số bộ phận khác nhau của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis)
in vitro (3 tháng tuổi) như lá, cuống lá và củ. Mô được nuôi cấy trên môi trường MS
bổ sung NAA và 2,4-D ở các nồng độ 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/L. Sau 10 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy nguồn mẫu từ lá là thích hợp nhất cho sự hình thành phơi trực tiếp. Mẫu cấy lá được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L NAA cho hiệu quả phát sinh phôi trực tiếp cao nhất (29,49 phơi/mẫu). Kết quả khảo sát hình thái giải phẫu cho thấy phôi phát triển trực tiếp từ các mẫu nuôi cấy [38].
Trong nghiên cứu của Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã nghiên cứu sự phát sinh hình thái từ LMTB (TCL) mẫu lá, cuống lá và thân rễ sâm Ngọc Linh in vitro. Mẫu được nuôi cấy trên mơi trường đặc MS có bổ sung 30 g/L đường, các chất ĐHST (NAA, 2,4-D, BA và TDZ riêng lẻ hoặc kết hợp). Sau 10 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy mẫu lá tTCL_L, mẫu cuống lá lTCL_C, mẫu thân rễ tTCL_R đều cho sự phát sinh phôi, mô sẹo, rễ, trong khi mẫu cuống lá tTCL_C chỉ cho sự phát sinh mơ sẹo và rễ. Trong đó, tỷ lệ phát sinh phơi cao nhất (89,6%), tỷ lệ phát sinh mô sẹo cao nhất (91 - 98,8%), tỷ lệ phát sinh rễ cao nhất (98,8%) đã được ghi nhận tương ứng khi mẫu lá tTCL_L được nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2 mg/L NAA và được đặt dưới điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày; lá tTCL_L, cuống lá tTCL_C, lTCL_C, thân rễ tTCL_R được ni cấy trên mơi trường có 2,4-D kết hợp với BA dưới điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, điều kiện tối hồn tồn; mơi trường có bổ sung 1 mg/L NAA và đặt trong điều kiện tối hoàn toàn. Điều kiện chiếu sáng có tác động đáng kể lên khả năng phát sinh hình
thái của mẫu cấy. Việc sử dụng đèn huỳnh quang chiếu sáng 16 h/ngày phù hợp cho khả năng phát sinh phôi của mẫu cấy, những phôi thu được có dạng hình cầu, hình tim, hình thủy lơi và cả dạng lá mầm. Ngược lại, điều kiện tối lại kích thích sự hình thành rễ và mơ sẹo tốt hơn. Rễ thu được có màu trắng đục, có phân nhánh, trong khi mơ sẹo lại xốp và có màu vàng nhạt [39]. Ở sâm Ngọc Linh, Mai Trường và cộng sự (2014) đã nghiên cứu tạo và nhân phơi vơ tính trong mơi trường lỏng. Lá chét của cây sâm 6 tháng tuổi ở vườn ươm (sau khử trùng) được nuôi cấy trên mơi trường MS có 1 mg/L 2,4-D và 0,2 mg/L kinetin để tạo mơ sẹo. Sau đó, mơ sẹo được cấy chuyền sang mơi trường MS lỏng (lắc) có 1 mg/L 2,4-D với 0,2 mg/L kinetin, 500 mg/L casein hydrolysate để tạo huyền phù tế bào. Sau 2 tháng, huyền phù tế bào được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường B5 lỏng (lắc) có 3 mg/L IBA. Sau nhiều tháng ni, rất nhiều phơi vơ tính dạng cầu hình thành và có khả năng nhân ổn định. Mảnh lá mầm (của cây mầm từ phơi) và phơi vơ tính non được ni cấy trên mơi trường MS có 10% nước dừa, có hoặc khơng có 0,2 mg/L IBA để tạo mơ sẹo sinh phơi và phôi thứ cấp. Mô sẹo sinh phôi và phôi thứ cấp này cũng đã được dùng để nuôi nhân trong mơi trường lỏng có và khơng có chất ĐHST ở quy mơ bình tam giác và bioreactor [40]. Những kết quả đã tạo cơ sở để nhân giống quy mô lớn và thu hợp chất thứ cấp.
Rễ bất định của cây Panax ginseng hoang dại và cây đột biến được nuôi cấy tạo mơ sẹo trên mơi trường MS có 0,5 mg/L 2,4-D và 0,3 mg/L kinetin. Mơ sẹo có khả năng sinh phơi được cấy chuyển sang mơi trường MS có 0,5 mg/L 2,4-D nhằm cảm ứng tạo phơi. Các phơi hình thành trưởng thành trên mơi trường MS có 5 mg/L GA3 và 85% phôi nẩy mầm [41].
Đỗ Mạnh Cường và cộng sự (2020) đã nghiên cứu làm tăng tỷ lệ phát sinh phơi vơ tính sâm Ngọc Linh qua khử trùng lá sâm bằng dung dịch nano bạc và nuôi cấy dùng môi trường cũng bổ sung nano bạc. Kết quả cho thấy tỷ lệ tạo mơ sẹo có khả năng sinh phơi cao nhất (72,22%), khối lượng tươi cao nhất (0,77 g) khi sử dụng dung dịch nano bạc xử lý trong 20 phút. Tỷ lệ phát sinh phôi và phôi nẩy mầm cao nhất trên mơi trường MS có 1 mg/L 2,4-D; 0,5 mg/L NAA; 02 mg/L Kin và 1,6 mg/L nano bạc. Việc bổ sung 1 mg/L NAA và 1,2 mg/L nano bạc cho kết quả tốt nhất về chiều cao chồi, chiều dài rễ, số rễ, khối lượng tươi/khô cây con [42].
Nguyễn Thị Ngọc Hương và cộng sự (2018) đã nghiên cứu hình thái học và tế bào học quá trình phát sinh phơi vơ tính gián tiếp qua giai đoạn mơ sẹo ở Tam thất hoang (Panax stipuleanatus). Ở nghiên cứu này, mô sẹo được cảm ứng từ mô thân rễ ni cấy trên mơi trường MS (½ khống đa lượng) có bổ sung 2 mg/L 2,4-D (giai đoạn nuôi 8 tuần) và 1 mg/L (giai đoạn nuôi 16 tuần). Khối mô sẹo bao gồm các cụm tế bào rời rạc và cụm tế bào đẳng kính được cấy chuyển sang ni cấy trên mơi trường có bổ sung 5 m/L NAA để tạo mơ sẹo có khả năng sinh phơi, kết quả cho thấy khối mơ sẹo trở nên mềm hơn với các cụm tế bào có khả năng tái sinh cao: kích thước nhỏ, đẳng kính, nhân to, nhân rõ và có tế bào chất đậm đặc. Sự hình thành các thể giống phơi cầu được ghi nhận sau 28 tuần nuôi trên mơi trường có NAA nêu trên. Các cấu trúc giống phơi này tiếp tục phát triển đến giai đoạn hậu phôi cầu, phơi dạng trái tim và dạng có lá mầm trên mơi trường MS như trên có bổ sung 0,5 mg/L BA và 1 mg/L GA3. Ngoài ra, cũng ghi nhận được một số dạng phát
triển bất thường của phôi như chỉ phát triển rễ/chồi hoặc chỉ có lá mầm [43].
1.2.1.2. Rễ bất định
Gao và cộng sự (2005) đã nghiên cứu sự tái sinh trực tiếp rễ bất định từ đoạn cuống lá (0,5-0,8 cm) và từ đoạn rễ nhánh (~ 1 cm) cây Panax notoginseng (3 năm tuổi). Kết quả cho thấy rễ bất định hình thành tốt từ mơ cuống lá ni cấy trên mơi trường MS có 3 mg/L IBA, có hoặc khơng bổ sung 0,1 mg/L kinetin. Mơ rễ nhánh mẫn cảm hơn đối với IBA trong q trình ni cấy tạo rễ bất định so với mô cuống lá. Khối lượng khô rễ bất định tăng 5,25 lần sau quá trình ni lỏng lắc trong mơi trường ½MS có 3 mg/L IBA [44].
Ba loại mơ dùng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh bao gồm mô sẹo lá chét, phôi/cụm phôi trưởng thành mang chồi và mô sẹo cứng. Rễ bất định hình thành ngay trong giai đoạn nuôi cấy mảnh lá (nuôi cấy một giai đoạn, không qua cấy chuyền) trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D và 10% nước dừa; rễ bất định cũng hình thành từ mơ sẹo cấy chuyền (ni cấy hai giai đoạn) trên mơi trường MS có 3 mg/L NAA, MS có 3 mg/L NAA, 2 mg/L 2,4-D, 5% (v/v) nước dừa và mơi trường B5 có 5 mg/L IBA. Ngồi ra, sự hình thành rễ bất định từ phơi/cụm phơi (đã loại bỏ hoàn toàn rễ trụ) cũng đã được ghi nhận qua ni cấy trên mơi trường ½MS bổ sung 2 - 3 mg/L NAA. Rễ bất định từ mơ sẹo cứng (từ mơi trường B5 có 5 mg/L IBA) đã được nghiên cứu nuôi cấy tiếp tục trên mơi trường đặc/lỏng White có 5 mg/L NAA, B5 có
1 - 5 mg/L IBA/NAA nhằm tìm hiểu khả năng tăng sinh khối qua quá trình tạo rễ thứ cấp. Nghiên cứu khả năng hình thành các sơ khởi rễ và phân nhánh rễ trên các mơi trường White/B5 có 1 - 5 mg/L IBA/NAA từ khúc cắt rễ bất định cũng đã được thực hiện [45].
Nguyễn Thị Ngọc Hương và cộng sự (2016) đã sử dụng các khúc cắt thân rễ
Panax stipuleanatus có đường kính 1 - 1,5 cm và dày 1 cm được nuôi cấy trên mơi
trường MS có bổ sung 30 g/L đường, 6 g/L agar, 0,5 mg/L 2,4-D và đặt trong tối. Mơ sẹo hình thành trên bề mặt thân rễ sau bốn tuần. Sự phân chia đầu tiên trong quá trình hình thành mô sẹo xảy ra trong hai tuần đầu, ở các tế bào nhu mô vỏ cấp hai và tượng tầng libe – mộc. Mô sẹo 26 tuần tuổi với các tế bào bên trong cụm chậm tăng trưởng và các tế bào ở phía ngồi cụm có xu hướng kéo dài được chuyển sang mơi trường hoạt hóa có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,1 mg/L TDZ trong 6 tuần. Mô sẹo phát triển trên môi trường này trở nên chặt hơn và hình thành nhiều cụm. Sự hình thành rễ bất định xảy ra sau 10 tuần khi mô sẹo được chuyển sang mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA. Mơ sẹo hình thành các cấu trúc hình cầu giống phơi tuy nhiên chỉ phát triển một cực rễ. Trong các rễ hình thành từ mơ sẹo thân rễ có sự hiện diện của saponin thuộc nhóm olean [46].
Nghiên cứu cải tiến quy trình nhân nhanh sinh khối rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh từ rễ bất định in vitro thông qua việc tối ưu nguồn mẫu, môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đã được thực hiện. Kết quả cho thấy, các rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh được hình thành từ vùng trụ bì tại vị trí của bó mạch dẫn trung tâm. Các mẫu rễ bất định dài 2 cm tái sinh từ cuống lá với 8 g rễ bất định/1,5 L mơi trường ni cấy trong bioreactor hình cầu có sục khí cho kết quả hình thành rễ thứ cấp tốt nhất trên môi trường MS cải biên với tỷ lệ ½NH4+/NO3- bổ sung 7 mg/L IBA, 0,5 mg/L BA và 30 g/L đường trong 56 ngày (45 ngày đầu trong tối, 11 ngày sau ngoài sáng) ở 22oC và pH 5,3 [47].
1.2.2. Chi Acanthopanax
1.2.2.1. Phơi vơ tính
Chi Aucanthopanax cịn có tên gọi khác là Eleutherococcus, đây là chi đã
được nghiên cứu khá nhiều về phơi vơ tính. Các mảnh lá mầm và thân phơi hợp tử
Acanthopanax senticosus tạo phơi vơ tính qua ni cấy trên mơi trường MS có 0,5
mơi trường MS có 2,4-D (0,5 mg/L) hoặc IAA (1-3 mg/L) hoặc Zeatin (0,5 mg/L) và NAA (0,2 mg/L). Các phơi vơ tính nẩy mầm (93%) trên môi trường MS không bổ sung 2,4-D. Phơi vơ tính có nguồn gốc từ cụm tế bào biểu mô và dưới biểu mô [48]. Các đoạn thân cây Acanthopanax koreanum Nakai tạo mơ sẹo có khả năng phát sinh phơi tốt qua nuôi cấy trên mơi trường MS chỉ bổ sung 4,5 µM 2,4-D. Mơ sẹo có khả năng phát sinh phôi chỉ tạo phôi cầu khi được nuôi cấy trong mơi trường lỏng có 0,45 µM 2,4-D; ngược lại, ghi nhận phôi phát triển đến giai đoạn trưởng thành, nẩy mầm khi được ni cấy trong mơi trường khơng có 2,4-D. Cytokinin ức chế sự phát triển bình thường của phơi nhưng kích thích sự phát sinh phơi thứ cấp trên bề mặt của phôi sơ cấp [49].
Park và cộng sự (2005) đã thực hiện nghiên cứu tạo phôi vô tính
Eleutherococcus koreanum từ ni cấy các đoạn rễ bất định trong môi trường lỏng
lắc. Kết quả cho thấy môi trường 1/3MS có 60 g/L đường, khơng bổ sung chất ĐHST là thích hợp cho sự hình thành phơi vơ tính. Phơi vơ tính phát triển đến giai đoạn trưởng thành và nẩy mầm trong môi trường 1/3MS không bổ sung chất ĐHST. Rễ bất định, phôi và cây con đã được thu nhận đồng thời sau 12 tuần nuôi cấy rễ bất định bằng bioreactor trong môi trường như trên [50]. Các kết quả nghiên cứu trên có ý nghĩa trong nhân giống và thu hợp chất thứ cấp.
Shohael và cộng sự (2007) đã nghiên cứu thu nhận các sản phẩm có giá trị như eleutherosides và acid chlorogenic từ phơi vơ tính có nguồn gốc ni cấy huyền phù tế bào có khả năng sinh phơi Eleutherococcus senticosus. Mơ tế bào được xử lý methyl jasmonate (50 - 400 µM), kết quả cho thấy hàm lượng eleutherosides, acid chlorogenic, khối lượng tươi/khô, tỷ lệ tăng trường phôi cao nhất khi được xử lý 200
µM methyl jasmonate [51].
1.2.2.2. Rễ bất định
Seo và cộng sự (2003) đã nghiên cứu nhân sinh khối rễ bất định
Eleutherococcus sessiliflorus bằng phương pháp nuôi lỏng lắc và bioreactor. Cảm ứng
tạo rễ được thực hiện bằng nuôi cấy mảnh mô trụ dưới lá mầm, đoạn rễ phơi vơ tính trên mơi trường đặc
½MS có bổ sung NAA, IBA và IAA. Kết quả cho thấy rễ hình thành từ mô trụ dưới lá mầm tốt hơn từ đoạn rễ. Trong các auxin được thí nghiệm, nhận thấy tỷ lệ tạo rễ cao nhất trên mơi trường có 0,5 mg/L NAA. Ở nuôi cấy lỏng lắc, hiệu quả tạo rễ ở mơi trường MS (khơng có NH4NO3) cao hơn trong môi trường MS và ½MS. Rễ tăng
tươi tốt trong mơi trường có 0,5 mg/L IBA. Hệ số nhân (5,5 lần) sau 1 tháng khi rễ