CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.3.1.6. Trồng cây con ở chậu đất
Các cây con 3 tháng tuổi được nuôi cấy trong bình tam giác (từ kết quả thí nghiệm trên), lấy ra khỏi bình tam giác, rửa sạch agar, bảo quản và đảm bảo độ ẩm tránh mất nước cho cây, sau đó được trồng ra chậu (có Ø ~ 20 cm) chứa đất sạch thương hiệu Tribat (Cty TNHH Cơng nghệ sinh học Sài Gịn Xanh, TP. HCM). Các chậu cây được đặt trong vườn ươm, trồng 1 cây con/chậu, 10 chậu/lần lặp lại, 3 lần lặp lại, ghi nhận tỷ lệ sống (%) và hình thái cơ bản của cây con ở thời điểm 3 tuần sau trồng.
Tỷ lệ sống (%) = (Số cây sống/số cây trồng) x 100%
Trồng cây ở vườn ươm với điều kiện che sáng ~ 50% bằng lưới đen (cường độ sáng ~ 8.000 lux), tưới phun 2 ngày/lần, nhiệt độ 30 - 32oC, độ ẩm 60 - 70%. Theo dõi, ghi nhận, đánh giá cảm quan hình thái cây đến giai đoạn 3 - 12 tháng sau trồng.
2.3.2. Tạo phơi vơ tính gián tiếp qua mơ sẹo từ nuôi cấy mô lá
2.3.2.1. Tạo phơi vơ tính gián tiếp qua mơ sẹo mảnh lá (10 x 10 mm)
Tạo mô sẹo
Vật liệu ni cấy: các mảnh lá có kích thước 10 x 10 mm
Mẫu được cấy vào mơi trường tạo mơ sẹo SH có bổ sung 2,4-D với các nồng độ (0; 1; 2; 3 mg/L), 30 g/L sucrose. Sau cấy 40 ngày, cấy chuyền các mẫu và nuôi tiếp trong 20 ngày nhằm để mơ sẹo hình thành trên tồn bộ bề mặt mảnh lá. Thí nghiệm được thực hiện trên các đĩa petri, cấy 5 mảnh lá/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại. Quan sát, theo dõi sự hình thành mô sẹo ở 20, 40, 60 NSC.
Cắt các mảnh lá mang mô sẹo (sau đây gọi tắt là mảnh mơ sẹo) ở 60 NSC nói trên thành các mảnh có kích thước (~ 10 x 10 mm/~ 1 cm2), ni cấy tiếp trong thời
gian 30 ngày để tạo mơ sẹo có khả năng sinh phơi (KNSP). Tiến hành cấy 5 mảnh mô sẹo/đĩa, cấy 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Theo dõi, ghi nhận các chỉ tiêu ở thời điểm 30 NSC: tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo có KNSP (%), số cụm mơ sẹo có KNSP/mẫu mơ sẹo.
Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
Xác định mơ sẹo có KNSP dựa vào đặc điểm hình thái, màu sắc, cấu trúc, mơ sẹo có KNSP: có dạng cứng, trắng hơi vàng, vàng, cấu trúc chắc, dạng cụm hoặc hạt, phát triển chậm. Mô sẹo khơng có KNSP có cấu trúc xốp, phát triển nhanh, màu trắng hoặc xám, mềm.
Tạo phôi từ mô sẹo nuôi trên môi trường đặc
Vật liệu ni cấy: các cụm mơ sẹo có KNSP
Các cụm mơ sẹo có KNSP thu từ thí nghiệm trên được cắt thành các cụm nhỏ có kích thước ~ 5 mm, cấy vào môi trường tạo phôi là mơi trường ni cấy có bổ sung loại auxin và nồng độ thích hợp của BA (kế thừa kết quả thí nghiệm tạo phơi trực tiếp). Loại auxin này được bố trí với các nồng độ 1; 2; 3; 4; 5 mg/L; có 30 g/L sucrose.
Tiến hành cấy 5 cụm mơ sẹo có KNSP/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố . Theo dõi, ghi nhận số liệu ở thời điểm 30 NSC với các chỉ tiêu theo dõi: số cụm mơ sẹo có KNSP tạo phơi, số phơi/cụm mơ sẹo có KNSP, đặc điểm hình thái phôi.
Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi tái sinh trên môi trường đặc
Sử dụng dao lam cắt ngang phôi tái sinh từ cụm mơ sẹo có KNSP ni trên mơi trường đặc để tạo các lát mỏng tế bào, tiếp theo các mẫu cắt được nhuộm bằng phương pháp nhuộm màu kép như trên [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.
Tạo phơi từ mơ sẹo ni trên mơi trường lỏng
Thí nghiệm được tiến hành với nguồn vật liệu là các cụm mơ sẹo có KNSP có đường kính khoảng 5 mm, cấy 30 cụm mơ sẹo có KNSP vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường kế thừa từ kết quả thí nghiệm trên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận sự hình thành phơi ở 10, 14, 30 NSC.
Quan sát, ghi nhận hình thái cụm tế bào sống (không nhuộm màu), cụm đa bào sinh phôi (qua nhuộm màu) (ở giai đoạn ~ 10 ngày ni lỏng lắc mơ sẹo có khả năng sinh phơi) dưới kính hiển vi soi ngược với độ phóng đại 50X, 20X, theo thứ tự.
2.3.2.2. Tạo phơi vơ tính gián tiếp qua mơ sẹo mảnh lá (3 x 10 mm)
Tạo mô sẹo từ nuôi cấy mảnh lá (3 x 10 mm)
Thí nghiệm này nhằm tạo nguồn vật liệu mô sẹo cho sự khảo sát tạo phơi sau đó. Vật liệu ni cấy được sử dụng là mảnh lá có kích thước 3 x 10 mm. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
Mẫu được cấy trên môi trường tạo mô sẹo là SH có bổ sung 2,4-D với các nồng độ 0; 1; 2; 3 mg/L, 30 g/L sucrose. Tiến hành cấy 10 mẫu/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Theo dõi, ghi nhận sự hình thành mơ sẹo, mơ sẹo có KNSP ở thời điểm 30 NSC.
Tạo phơi
Vật liệu ni cấy: mơ sẹo hình thành từ thí nghiệm 2.3.2.2
Mẫu mơ sẹo được cấy vào môi trường tạo phôi giống mơi trường ni cấy của thí nghiệm tạo phơi ở môi trường đặc. Tiến hành cấy 5 mẫu mô sẹo/đĩa, cấy 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố và hoàn toàn ngẫu nhiên. Theo dõi, quan sát sự hình thành phơi; thu thập số liệu ở thời điểm 30 NSC với các chỉ tiêu: số mẫu mô sẹo tạo phôi, số phôi/mẫu mô sẹo. Tiếp tục quan sát, ghi nhận sự phát triển của phôi ở giai đoạn 60 NSC (không thu thập số liệu).
2.3.3. Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi
Phơi vơ tính được xác định là một trong bốn dạng hình thái phát triển của phôi: dạng phôi cầu, phôi tim, phôi thủy lôi, dạng phơi trưởng thành (dạng phân cực có tiền lá mầm và tiền rễ). Đếm phôi bằng cách quan sát dưới kính lúp và ghi nhận số phơi.
Tiến hành lấy chỉ tiêu theo dõi với 30 mẫu cho mỗi nghiệm thức.
Các chỉ tiêu ở thí nghiệm tạo phơi trực tiếp, theo dõi và thu thập số liệu ở thời điểm ngày thứ 60 sau cấy:
Tỷ lệ mẫu tạo phôi (%) = (Số mẫu tạo phôi/số mẫu cấy) x 100%
Số phôi/mẫu = Tổng số phơi/số mẫu tạo phơi
Các chỉ tiêu ở thí nghiệm tạo phơi gián tiếp, theo dõi và thu thập số liệu ở thời điểm ngày thứ 30 sau cấy:
Tỷ lệ mẫu tạo mơ sẹo có KNSP (%) = (� �ẫ� �ạ� � �ẹ� � ����ố ơ ó ) x 100%
ố ơ
Số cụm mơ sẹo có KNSP/mẫu = �ố �ụ� ơ
� �ẹ� �ó
ố ơ ó
� �ẫ� � �ẹ� � ����
Số phôi/cụm mô sẹo = ����
�ổ�� �ố � �ụ� � �ẹ� �ạ� � ô�ố ơ ℎ
2.4. Nội dung 2. Nhân phơi vơ tính
2.4.1. Nhân phôi trên môi trường đặc
Vật liệu nuôi cấy là các cụm phơi vơ tính sơ cấp (hình thành từ mảnh lá). Môi trường nhân phôi được sử dụng từ kết quả của thí nghiệm tạo phơi trực tiếp từ mảnh lá về mơi trường khống, loại auxin, nồng độ BA. Loại auxin này được sử dụng với các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/L), 30 g/L sucrose. Thí nghiệm được bố trí trên các đĩa petri, theo kiểu đơn yếu tố và hồn tồn ngẫu nhiên. Cấy 5 cụm phơi/đĩa (3 phơi/cụm), 6 đĩa/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về số phôi/cụm phôi, hệ số nhân phơi, quan sát đặc điểm hình thái phơi, cụm phơi ở 30 NSC. Chú ý quan sát sự hình thành phơi thứ cấp ở các bộ phận (từ thân, lá, rễ) của phôi sơ cấp.
2.4.2. Nhân phôi trong môi trường lỏng
2.4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng đến sự tạo phơi thứ cấp qua nuôi lỏng lắc
Sử dụng kết quả của thí nghiệm trên làm cơ sở cho thí nghiệm khảo sát tác động của các chất ĐHST đến sự phát sinh phơi thứ cấp trong mơi trường lỏng. Do đó, mơi trường ni cấy được kế thừa về mơi trường khống, các mức nồng độ của loại auxin có phát sinh phơi tích cực và nồng độ BA; ni cấy lỏng lắc. Sử dụng máy lắc hiệu SARTORIUS của Đức, thực hiện nuôi lỏng lắc với 80 vịng/phút.
Vật liệu ni cấy là các phơi đơn 60 ngày tuổi (từ thí nghiệm tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mơ lá).
Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác V250 mL, chứa 60 mL mơi trường ni cấy, ni lỏng lắc 80 vịng/phút, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 30 phơi/bình. Quan sát, theo dõi thí nghiệm, thu thập số liệu về số phơi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái và màu sắc phơi ở 30 NSC.
2.4.2.2. Ảnh hưởng của khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi phôi
Vật liệu nuôi cấy: sử dụng phôi qua nuôi cấy lỏng lắc sau 60 ngày ni cấy từ phơi 60 ngày tuổi của các thí nghiệm tạo phơi vơ tính trực tiếp từ mơ lá.
Để khảo sát ảnh hưởng khối lượng phôi nuôi cấy đến sự tăng trưởng sinh khối phôi, sử dụng khối lượng phôi ban đầu như sau: 0,3; 0,6; 1,2; 1,8 g tương ứng với 0,5%, 1%, 2% và 3% (w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường ni cấy kế thừa thí nghiệm ảnh hưởng chất ĐHST, 30 g/L đường. Thu thập số liệu về khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần) và đặc điểm hình thái phơi/cụm phơi ở 30 NSC.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi
2.4.2.3. Ảnh hưởng của kích thước phơi ni cấy đến sự tạo phơi thứ cấp
Sử dụng vật liệu là các phơi vơ tính với các kích thước khác nhau: kích thước nhỏ (7 - 8 mm), trung bình (~ 10 mm), to (~ 15 mm). Tiến hành cấy 30 phơi nhỏ/trung bình/to vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường ni cấy giống thí nghiệm ảnh hưởng khối lượng phơi ni cấy, có 30 g/L đường.
Thí nghiệm bố trí theo kiểu đơn yếu tố, cấy 3 bình/lần lặp lại, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi và thu thập số liệu về số phôi thứ cấp hình thành, đặc điểm hình thái, màu sắc phơi/ cụm phơi hình thành ở 30 NSC.
2.4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Cấy khối lượng phôi 0,3 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường như thí nghiệm trên, sucrose được khảo sát với các mức nồng độ (20, 30, 40, 50 g/L); mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần) và đặc điểm hình thái, màu sắc phơi/cụm phơi ở 45 NSC. Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố
2.4.2.5. Ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng trưởng sinh khối phôi
Cấy khối lượng phôi 0,30 g (0,5% - w/v) vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL môi trường như trên, 30 g/L sucrose, nuôi ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau: tối (0 lux), chiếu sáng với cường độ 2.000 lux (~ 27 μmol m� ô�ℎ
-2 s-1), 4.000 lux (~ 54 μmol m-2 s-1), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Quan sát, theo dõi, thu thập số liệu về
khối lượng tươi phôi (g), hệ số nhân phôi (lần), đặc điểm hình thái, màu sắc phơi/cụm phơi ở 30 NSC. Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố.
2.4.2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước dừa đến sự tạo phôi thứ cấp
Các phơi đơn có kích thước trung bình (~ 10 mm) được cấy vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường thí nghiệm ảnh hưởng khối lượng phơi ni cấy trên, 30 g/L sucrose, nước dừa được khảo sát với các mức tỷ lệ (0%, 5%, 10%). Cấy 30 phơi đơn/bình, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thu thập số liệu về số phơi hình thành, đặc điểm hình thái, màu sắc phơi/cụm phơi ở 21 NSC.
Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu đơn yếu tố
2.4.2.7. Tạo cây con từ phôi nuôi lỏng lắc
Sử dụng các phơi đơn có kích thước trung bình (~ 10 mm), cấy vào bình tam giác V250 mL chứa 60 mL mơi trường MS hoặc ½MS (1/2 khống đa lượng) [105]
khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, 20 g/L sucrose, cấy 30 phơi đơn/bình, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần; quan sát, ghi nhận sự phát triển phôi đến giai đoạn trưởng thành ở 14 NSC. Sau đó, cấy chuyển phơi sang mơi trường đặc thích hợp (kế thừa kết quả thí nghiệm) để phôi phát triển thành cây con trong 60 ngày.
2.4.3. Quan sát cấu trúc giải phẫu phôi sơ cấp và thứ cấp
Cắt tạo các LMTB dọc thân phôi/rễ, ngang phiến lá mầm (của phôi sơ cấp) mang phôi thứ cấp bằng dao lam, mẫu cắt được nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép của Bộ môn Thực vật - Khoa Dược, ĐH. Y Dược TP. HCM [43]. Quan sát tiêu bản bằng kính hiển vi soi nổi Leica (vật kính 20X) và chụp hình.
2.4.4. Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xác định
Số phôi/cụm phôi = Tổng số phôi/số cụm phôi
Hệ số nhân phôi = Số phôi/cụm phôi� � ô� ố ℎ �ấ�/�ụ�
Khối lượng tươi phôi thu nhận (g): Thu và cân sinh khối lượng phôi ở mỗi nghiệm thức sau 30 ngày nuôi.
Hệ số nhân sinh khối phôi (lần) = � ố� � ợ�� � ơ� � ô� �ℎ� ℎℎ� ố� � ợ�� � ô� ��ô� �ấ�ℎ ư ư ư ℎ ℎ � ậ�(�)(�)
2.5. Nội dung 3. Tạo rễ bất định
2.5.1. Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
2.5.1.1. Ảnh hưởng của auxin (NAA/IBA) và mơi trường khống đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá định trực tiếp từ mô lá
Khảo sát tác động của riêng lẻ của auxin và mơi trường khống lên sự cảm ứng tạo rễ bất định của mô lá, nhằm xác định loại và nồng độ auxin thích hợp, trên mơi trường khống thích hợp.
Sử dụng vật liệu là các mảnh lá I (10 x 10 mm), mảnh lá II (3 x 10 mm), cấy úp mặt trên lá tiếp xúc vào mơi trường MS, ½MS, B5 và SH có bổ sung các chất ĐHST riêng lẻ NAA/IBA có cùng nồng độ (0; 0,5; 1; 2; 3; 4; 5) mg/L, 30 g/L sucrose, chiếu sáng 4.000 lux, 12 h chiếu sáng/ngày. Cấy 5 mảnh lá I/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; 10 mảnh lá II/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên theo kiểu hai yếu tố: yếu tố về các mức nồng độ của NAA/IBA và yếu tố về mơi trường khống với 4 mơi trường khác nhau (MS, ½MS, B5, SH). Theo dõi thí nghiệm, thu thập số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm) ở thời điểm 30 NSC.
2.5.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá
Nhằm khảo sát sự tác động của nồng độ đường đến sự phát sinh rễ từ các mẫu cấy mảnh lá, sử dụng mơi trường khống với chất ĐHST (NAA/IBA) có nồng độ tạo rễ tích cực nhất (kế thừa từ thí nghiệm trên), có đường với các nồng độ khác nhau (20; 30; 40; 50 g/L) làm môi trường nuôi cấy.
Vật liệu nuôi cấy: mảnh lá I (10 x 10 mm), mảnh lá II (3 x 10 mm). Mẫu được cấy vào môi trường nuôi cấy trên với 5 mảnh lá I/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; 10 mảnh lá II/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, theo kiểu đơn yếu tố. Theo dõi thí nghiệm, số liệu về tỷ lệ mẫu tạo rễ (%), số rễ/mẫu, chiều dài rễ (mm) được thu thập ở thời điểm 30 NSC.
2.5.1.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự tạo rễ bất định trực tiếp từ môlá lá
Để khảo sát điều kiện chiếu sáng có tác động đến sự phát sinh rễ bất định từ mảnh lá, tiến hành cấy mẫu trên mơi trường khống, có loại và nồng độ auxin thích hợp, nồng độ sucrose có tác động hiệu quả nhất đến sự phát sinh rễ bất định từ mảnh lá (kế thừa kết quả từ hai thí nghiệm trên). Các đĩa mẫu cấy được đặt ở điều kiện chiếu sáng khác nhau 4.000 lux, 2.000 lux, tối hoàn toàn.
Sử dụng vật liệu nuôi cấy là các mảnh lá I (10 x 10 mm) và mảnh lá II (3 x 10 mm). Với mảnh lá I cấy 5 mẫu/đĩa, 6 đĩa/lần lặp lại; mảnh lá II cấy 10 mẫu/đĩa, 3 đĩa/lần lặp lại; mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu
nhiên, theo kiểu đơn yếu tố. Quan sát, theo dõi thí nghiệm, ghi nhận số liệu về tỷ lệ