Các hợp chất cũng ức chế HDAC với giá trị IC50 cỡ µM. Kết quả từ nghiên cứu này chỉ ra rằng các hợp chất có cấu trúc kiểu N-hydroxypropenamid mạnh hơn các hợp chất N-hydroxybenzamid. Nghiên cứu docking với trung tâm hoạt động enzym HDAC2 cho thấy các dẫn chất N-hydroxypropenamid có vị trí tương tác tương tự chất chứng SAHA nhưng ái lực liên kết thường cao hơn.
Các thiết kế trên đều dựa trên cấu trúc của dẫn chất N-hydroxyacrylamid cho thấy một số chất ức chế HDAC tiềm năng hứa hẹn để đánh giá thêm.
1.4. CÁC PHẢN ỨNG DÙNG TRONG TỔNG HỢP CÁC DẪN CHẤT N-HYDRYACRYLAMID MANG KHUNG 2H-1,4-BENZOXAZIN-3(4H)-ON HYDRYACRYLAMID MANG KHUNG 2H-1,4-BENZOXAZIN-3(4H)-ON
1.4.1. Phản ứng thế ái nhân
Cho 6-bromo-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-on tác dụng với các dẫn chất halogen R- X trong điều kiện thích hợp. Phản ứng xảy ra theo cơ chế SN2 như sau:
Nu C H H X C H H X Nu C H H Nu + X
Sơ đồ 1. 1. Cơ chế phản ứng thế ái nhân SN2
Trong đề tài này, tác nhân được sử dụng là R-Br để tạo ra các dẫn chất thế bởi dẫn chất bromid giá thành thấp, bền, sẵn có và khả năng phản ứng tốt. Còn dẫn chất F, Cl khó phản ứng, Iod thường kém bền và giá thành cao, nên lựa chọn dẫn chất bromid
Trạng thái chuyển tiếp
R= H R= 2-Cl R= 3-Cl R= 4-Cl R= 4-OCH3
là hợp lý nhất. Phản ứng được tiến hành với dung môi DMF; xúc tác K2CO3, KI; nhiệt độ 50-600C.
1.4.2. Phản ứng Heck
Chu trình bắt đầu từ phản ứng khử Pd(II) về Pd(0) kèm theo sự trao đổi phối tử. Trong quá trình này, các tiểu phân xúc tác hoạt động được hình thành. Phản ứng khử của Pd(II) về Pd(0) được thực hiện bởi phối tử triphenyl phosphin trong hệ phản ứng sử dụng phối tử này. Với hệ xúc tác không có phối tử phosphin, alken và amin có thể đóng vai trò làm chất khử. Sự hình thành Pd(0) trong hỗn hợp phản ứng do sự khử Pd(II) bởi một số phối tử như amin, phosphin hoặc alken được mô tả bằng sơ đồ sau [7]
Sơ đồ 1. 2. Sự khử Pd(II) thành Pd(0) trong hỗn hợp phản ứng
Sau khi được sinh ra từ quá trình khử từ Pd(II), phức hợp Pd(0)L2 sẽ đi vào chu trình xúc tác gồm các bước: cộng hợp - oxy hóa với sự tham gia của R-X, cộng hợp syn với vinyl halogenid, tách loại β-hydrid (syn), tách khử và tái tạo lại Pd(0)L2. Bất kỳ giai đoạn nào trong 4 bước đều có thể quyết định tốc độ phản ứng tùy thuộc vào đặc tính của các chất tham gia cũng như điều kiện phản ứng [6,12].
Sơ đồ 1. 3. Cơ chế phản ứng Heck dựa trên chu trình Pd(0)/Pd(II)
- Bước 1: Cộng hợp – oxy hóa
Bước này xảy ra trong một chu trình cộng đồng bộ trong đó quá trình phá vỡ liên kết giữa C-X xảy ra đồng thời với quá trình hình thành liên kết Pd-C và Pd-X tạo thành
phức trung gian RPdIIXL2 ở cấu hình cis-. Sau đó, phức trung gian này sẽ đồng phân hóa về cấu hình trans- để bền hơn về mặt nhiệt động [6,12]
-Bước 2: Giai đoạn cộng hợp syn
Quá trình tạo phối trí giữa alken và sản phẩm trung gian của giai đoạn cộng hợp oxy hóa là giai đoạn tạo liên kết C-C dẫn đến sự hình thành sản phẩm. Giai đoạn này quyết định đến sự chọn lọc vị trí và chọn lọc lập thể của phản ứng ghép cặp chéo. Để tạo ra sự phối trí này, nguyên tử Pd, alken và hợp phần aryl phải đồng phẳng. Như vậy, giai đoạn tạo phối trí này xảy ra theo kiểu cộng hợp syn với nối đôi alken. Việc tạo phối trí của alken với nguyên tử trung tâm đòi hỏi phải có một vị trí phối trí trống khi một phối tử của palladi tách ra [6,12].
Sự chọn lọc vị trí của phản ứng Heck phụ thuộc rất nhiều vào cấu trúc của phối tử vì phối tử sẽ quyết định cách thức phản ứng xảy ra trong giai đoạn tạo phối trí. Giai đoạn cộng hợp phần aryl R trong phức hợp RPdX vào alken đang phối trí có thể xảy ra theo 3 cách sau, trong đó yếu tố không gian có vai trò quyết định:
+ Cách 1: hợp phần aryl R tác dụng như một carbanion, giai đoạn cộng này có thể coi là cộng ái nhân.
+ Cách 2: phức hợp RPdX hoặc RPd+ cộng vào liên kết đôi alken theo kiểu cộng ái điện tử.
+ Cách 3: RPdX và RPd+ cộng đồng thời vào liên kết đôi alken [6,12]. -Bước 3: Giai đoạn tách loại β-hydrid (syn)
Sản phẩm trung gian alkyl Pd sau giai đoạn cộng hợp syn- sẽ chuyển thành sản phẩm thông qua giai đoạn tách loại β-hydrid kiểu syn-. Trong giai đoạn này, nguyên tử Pd và nguyên tử H-β bị tách phải ở vị trí syn- và đồng phẳng. Khi xảy ra phản ứng tách có sự tương tác mạnh kiểu agostic giữa nguyên tử Pd và nguyên tử H-β, cặp điện tử của liên kết C-H đi vào orbital d trống của Pd tạo liên kết tam nhị hay liên kết ba tâm (3c- 2e: three-center two-electron bond). Kiểu tách này xảy ra đồng thời và không cần có sự tham gia của base. Giai đoạn tách loại kiểu β thực chất là một phản ứng thuận nghịch, trong đó HPdIIL2X vẫn đang phối trí với liên kết đôi alken C=C vừa tạo thành. Việc cộng tách thuận nghịch của phức Pd-hydrid vào liên kết đôi alken có thể dẫn đến sự đồng phân hóa. Để tránh hiện tượng này, người ta thêm vào phản ứng một số muối của Ag(I) hoặc Tl(I) nhằm tách loại hydro halogenid. HPdL2X thậm chí còn có thể phối trí với alken ban đầu, đồng phân hóa nó và từ alken đồng phân này sẽ tạo ra hỗn hợp sản
phẩm đồng phân Heck. Do vậy, mặc dù sản phẩm thu được thường ưu tiên cấu hình E-
nhưng nếu xảy ra quá trình đồng phân hóa sau giai đoạn tách loại β-hydrid sẽ tạo ra hỗn hợp sản phẩm [6,12].
- Bước 4: Giai đoạn tách khử, tái tạo lại L2Pd(0)
Giai đoạn cuối cùng này cần có sự có mặt của base để tái tạo lại chất xúc tác hoạt động L2Pd(0) bằng phản ứng tách khử từ sản phẩm HPdIIL2X của giai đoạn tách β- hydrid. Các base thường được sử dụng ở giai đoạn này là các amin như Et3N, (iPr)2NH hoặc các muối vô cơ như NaHCO3, NaOAc hoặc K2CO3 [6,12].
1.4.3. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester
Acid hydroxamic là sản phẩm của phản ứng giữa dẫn chất của acid carboxylic và hydroxylamin. Dẫn chất của acid carboxylic có thể là ester, acid clorid, anhydrid… Cho đến nay, nhiều phương pháp tổng hợp acid hydroxamic sử dụng các xúc tác khác nhau đã được công bố. Tuy nhiên sau khi tham khảo tài liệu cũng như dựa trên điều kiện hóa chất, dung môi phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester.
Đây là phương pháp được nhiều nhóm nghiên cứu áp dụng để tổng hợp các acid hydroxamic; ví dụ như Dương Tiến Anh và cộng sự (2019) [9] tổng hợp acid hydroxamic từ ester phản ứng với hydroxylamin trong dung môi DMF ở môi trường kiềm NaOH. Phản ứng xảy ra ở điều kiện 00C. (Sơ đồ 1.3)
Sơ đồ 1. 4. Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic trong nghiên cứu của tác giả Dương
Tiến Anh
Trong một số trường hợp, tùy thuộc vào bản chất của ester tham gia mà điều kiện phản ứng và dung môi phản ứng có thể thay đổi. Ví dụ, trong nghiên cứu tổng hợp các acid acridin hydroxamic với tác dụng ức chế đồng thời HDAC và topoisomerase của J. Chen và cộng sự năm 2018 [14], dung môi phản ứng lại là hỗn hợp CH3OH : CH2Cl2 và tiến hành ở nhiệt độ phòng.
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp: đạt tiêu chuẩn dùng cho tổng hợp hóa dược (tinh khiết phân tích Analytical Reagent - AR), được đặt mua từ các nhà cung cấp trong nước hoặc nước ngoài (Merck, Sigma-Aldrich). Một số dung môi dùng để chiết tách, phân lập được mua từ các nhà cung cấp của Trung Quốc. Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào, được liệt kê chi tiết dưới bảng sau:
STT Nguyên liệu STT Nguyên liệu
1 4-benzyl-6-bromo-2H-1,4- benzoxazin-3(4H)-on
14 Dicloromethan (DCM)
2 Benzyl bromid 15 Methanol
3 Hydroxylamin hydroclorid 16 Palladium diacetat
4 1-(bromomethyl)-2-fluorobenzen 17 Triphenylphosphin (Ph3P) 5 1-(bromomethyl)-3-fluorobenzen 18 K2CO3
6 1-(bromomethyl)-4-fluorobenzen 19 Ethyl acrylat
7 1-(bromomethyl)-4-clorobenzen 20 Trietylamin (TEA khan)
8 1-bromo-4-(bromomethyl)benzen 21 HCl 5%
9 1-(bromomethyl)-4-methylbenzen 22 Natri hydroxyd (NaOH) 10 Bromomethyl cyclopropan 23 Sắt (III) clorid (FeCl3)
11 Bromomethyl cyclohexan 24 Ethyl acetat
12 1-bromo-2-cloroethan 25 KI
13 N,N-dimethylformamid (DMF)
Các hóa chất và dung môi khác: nước cất, aceton, silicagel dùng cho sắc ký cột
2.2. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
- Bình cầu đáy tròn dung tích 50ml có nút mài, bình nón, bình chiết, ống đong, sinh hàn hồi lưu, pipet, phễu thủy tinh, cốc cỏ mỏ các loại
- Bình chạy sắc ký lớp mỏng, đèn tử ngoại, bản mỏng silicagel GF254(Merck) - Cân phân tích, cân kỹ thuật, tủ lạnh, tủ sấy
- Máy đo phổ hồng ngoại (IR): Shimadzu FTIR Affinity-1S
- Máy đo phổ khối lượng (MS): máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM
- Máy đo phổ công hưởng từ hạ nhân (1H-NRM) và carbon (13C-NRM): máy Bruker AV-500
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1. Tổng hợp hóa học 2.3.1. Tổng hợp hóa học Tổng hợp 10 chất: ✓ (E)-3-(4-(2-cloroethyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-3-(4-(cyclopropylmethyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-3-(4-(cyclohexylmethyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-3-(4-benzyl-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-3-(4-(2-fluorobenzyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-3-(4-(3-fluorobenzyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-3-(4-(4-fluorobenzyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-3-(4-(4-clorobenzyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-3-(4-(4-bromobenzyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6-yl)-N- hydroxyacrylamid ✓ (E)-N-hydroxy-3-(4-(4-methylbenzyl)-3-oxo-3,4-dihydro-2H-1,4-benzoxazin-6- yl)acrylamid R = Cloromethyl R= R= R= R= R = R= R= R= R=
2.3.2. Thử tác hoạt tính sinh học của các dẫn chất tổng hợp được
- Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư phổi ở người Sk-LU-1
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Tổng hợp hóa học 2.4.1. Tổng hợp hóa học
2.4.1.1. Tổng hợp
Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất. Tổng hợp 10 dẫn chất theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2. 1. Sơ đồ phản ứng tổng hợp các dẫn chất mang khung 2H-1,4-benzoxazin-
3(4H)-on
Quy trình tổng hợp gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: thực hiện phản ứng N-alkyl hóa (thế ái nhân alkyl) - Giai đoạn 2: thực hiện phản ứng Heck
- Giai đoạn 3: thực hiện phản ứng thế ái nhân acyl tạo acid hydroxamic với chất tham gia phản ứng là hydroxylamin hydroclorid.
2.4.1.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết
Sắc ký lớp mỏng: dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời gian điểm kết thúc phản ứng, kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế.
Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silicagel Merk 60 tráng sẵn, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của từng chất. Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp. Để bản mỏng trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho dung môi chạy khoảng 8 cm. Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sòng 254 nm.
Nhiệt độ nóng chảy: đo bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất
2.4.1.3. Xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được
Các dẫn chất sau khi tổng hợp, kiểm tra độ tinh khiết sẽ được khẳng định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- NMR và 13C-NMR)
- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1. Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm. Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1.
- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(+)-HR-MS, dung môi MeOH.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K, dung môi DMSO-d6.
2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.4.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế histon deacetylase
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc.Emzym HDAC được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit. Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit thử nghiệm. Tóm tắt các bước như sau:
- Bước 1: enzym HDAC được ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau ở 370C trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang.
- Bước 2: Thêm HDAC assay developer vào mỗi lô. Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
- Bước 3: Đọc kết quả độ hấp thụ trên máy đo huỳnh quang tại bước sóng kích thích 350-360 nm và bước sóng phát quang 440-460 nm.
2.4.2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro được thực hiện tại Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam – Viện công nghệ sinh học theo phương pháp SRB [41]. Dòng tế bào thử nghiệm: Sk-LU-1: tế bào ung thư phổi do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp. Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM hoặc MEME, có bổ sung thêm L- glutamine, sodium pyruvat, NaHCO3, penicillin/streptomycin, 10% FBS (Fetal Bovine Serum), Trypsin-EDTA (0.05%)
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện
in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan et al. (1990) [41]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
+ Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
+ Chất thử đã pha ở các nồng độ được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 μL) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%. + Ủ trong tủ ấm 370C trong 72 giờ. Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 370C, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
+ 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết