2.4.1. Tổng hợp hóa học
2.4.1.1. Tổng hợp
Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất. Tổng hợp 10 dẫn chất theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 2. 1. Sơ đồ phản ứng tổng hợp các dẫn chất mang khung 2H-1,4-benzoxazin-
3(4H)-on
Quy trình tổng hợp gồm 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: thực hiện phản ứng N-alkyl hóa (thế ái nhân alkyl) - Giai đoạn 2: thực hiện phản ứng Heck
- Giai đoạn 3: thực hiện phản ứng thế ái nhân acyl tạo acid hydroxamic với chất tham gia phản ứng là hydroxylamin hydroclorid.
2.4.1.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết
Sắc ký lớp mỏng: dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời gian điểm kết thúc phản ứng, kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế.
Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silicagel Merk 60 tráng sẵn, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của từng chất. Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp. Để bản mỏng trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho dung môi chạy khoảng 8 cm. Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sòng 254 nm.
Nhiệt độ nóng chảy: đo bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện để kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất
2.4.1.3. Xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được
Các dẫn chất sau khi tổng hợp, kiểm tra độ tinh khiết sẽ được khẳng định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- NMR và 13C-NMR)
- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1. Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm. Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1.
- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(+)-HR-MS, dung môi MeOH.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K, dung môi DMSO-d6.
2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.4.2.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế histon deacetylase
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc.Emzym HDAC được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit. Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit thử nghiệm. Tóm tắt các bước như sau:
- Bước 1: enzym HDAC được ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau ở 370C trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang.
- Bước 2: Thêm HDAC assay developer vào mỗi lô. Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
- Bước 3: Đọc kết quả độ hấp thụ trên máy đo huỳnh quang tại bước sóng kích thích 350-360 nm và bước sóng phát quang 440-460 nm.
2.4.2.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro được thực hiện tại Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam – Viện công nghệ sinh học theo phương pháp SRB [41]. Dòng tế bào thử nghiệm: Sk-LU-1: tế bào ung thư phổi do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp. Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM hoặc MEME, có bổ sung thêm L- glutamine, sodium pyruvat, NaHCO3, penicillin/streptomycin, 10% FBS (Fetal Bovine Serum), Trypsin-EDTA (0.05%)
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện
in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan et al. (1990) [41]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
+ Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
+ Chất thử đã pha ở các nồng độ được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 μL) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%. + Ủ trong tủ ấm 370C trong 72 giờ. Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 370C, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
+ 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek).
+ Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
% ức chế = 100% −OD(mẫu) − OD(ngày0)
OD(DMSO) − OD(ngày0)
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồngđộ 10 μg/mL; 2 μg/mL; 0,4 μg/mL; 0,08 μg/mL được sử dụng như là chất đối chứng tham khảo.
- DMSO 1% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.