1. Làm tiêu bản vi sinh vật cố định.
1.1. Các đặc điểm của vi sinh vật cố định.
Quan sát tiêu bản cố định là một phương pháp phổ biến trong nghiên cứu vi sinh vật học vì nó có ưu điểm sau:
- Đơn giản, dễ làm.
- Cho phép ta quan sát rõ hình thái và một số cấu tạo của tế bào vi sinh vật hay định lượng vi sinh vật.
- Không sợ bị lây nhiễm khi làm việc với vi sinh vật gây bệnh.
1.2. Các thao tác làm tiêu bản. 1.2.1. Làm vết bôi
- Chuẩn bị một phiến kính sạch và khô
- Lấy canh trường vi sinh vật: dùng que cấy vòng vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, làm nguội. Mở nút bông hơ miệng ống nghiệm chứa canh trường quanh ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy lấy canh trường sau đó nút bông kín.
- Nghiêng que cấy 10 - 15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường ra khắp diện tích đã khoanh. Làm xong, sát trùng que cấy để lên giá.
Chú ý:
- Vết bôi tròn, gọn và thật mỏng.
- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều, tách dời nhau.
1.2.2. Làm khô vết bôi
- Để vết bôi khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên phần không khí nóng của đèn cồn cho nhanh. Tránh đốt nóng trực tiếp vì như vậy tế bào bị quắt lại, cấu tạo của nó bị thay đổi. Phải để vết bôi thật khô mới làm tiếp tục.
1.2.3. Cố định vết bôi
a) Mục đích:
Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:
- Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là loại vi sinh vật gây bệnh).
- Gắn chặt vi sinh vật vào phiến kính để lúc nhuộm, rửa chúng không bị trôi.
b) Phương pháp
- Phương pháp dùng nhiệt: Là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất. Kẹp phiến kính giữa hai ngón tay các và trỏ, hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn đèn cồn, tránh không để tiêu bản nóng quá.
- Phương pháp dùng hóa chất: Khi nghiên cứu cấu tạo tế bào thì cố định bằng cách hơ nóng không lợi mà phải cố định bằng hóa chất vì cách này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào và không làm đứt các tiên mao. Người ta thường dùng hóa chất là các loại rượu hay axeton và thực hiện một trong những cách sau:
+ Rượu etylic: Nhỏ rượu lên vết bôi hoặc nhúng vết bôi vào rượu. Rượu tuyệt đối tác dụng tức thời, rượu 950 ngâm trong 5 - 15 phút, rượu càng loãng thời gian càng lâu.
+ Rượu metylic trong 2-5 phút.
+ Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút.
+ Dùng rượu etylic và đốt cháy: nhỏ vài giọt rượu 90 – 95o lên vết bôi rồi đốt cháy và dập tắt ngay. Làm thế vài lần rồi để khô.
2. Nhuộm màu. Nguyên tắc:
- Vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm là một quá trình hấp phụ nên cần sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng, bền vững. Thuốc nhuộm thường dùng là các chất màu anilin, chủ yếu là loại kiềm và trung tính.
- Vì thành phần hóa học của tế bào các loài vi sinh vật cũng như các bộ phận trong tế bào rất khác nhau nên khả năng và mức độ bắt màu không giống nhau. Tùy theo mục đích nghiên cứu mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp.
à Có hai phương pháp nhuộm chính: nhuộm đơn giản và nhuộm phức tạp
2.1. Nhuộm đơn giản.
- Định nghĩa: Trên tiêu bản chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm.
è Các bước tiến hành: Vết bôi đã cố định phải để khô mới đem nhuộm.
- Đặt tiêu bản lên cầu thủy tinh (gác nằm ngang trên miệng bocan).
- Nhỏ thuốc nhuộm phủ đều vết bôi. Chú ý không cho thuốc nhuộm nhiều quá và trong suốt thời gian nhuộm, trên vết bôi luôn có một lớp thuốc nhuộm phủ đều.
- Thời gian nhuộm tùy tính chất tiêu bản và loại thuốc nhuộm đem dùng. Trong điều kiện nhiệt độ phòng, đối với thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl cần để yên 1 - 2 phút còn xanh metylen là 3 – 5 phút. Để tăng cường tác dụng của thuốc nhuộm và rút ngắn thời gian nhuộm có thể hơ nhẹ phía dưới phía kính trên đèn cồn.
- Khi nhuộm xong, đổ hết thuốc nhuộm đi, rửa sạch bằng các nghiêng phiến kính và cho một dòng nước chảy nhẹ qua. Nước sẽ kéo thuốc nhuộm đi. Chú ý không xối nước trực tiếp lên vết bôi để tránh bị trôi vi sinh vật.
- Vẩy nước, dùng giấy thấm khô hoặc hơ nhẹ trên đèn cồn.
- Quan sát tiêu bản ở vật kính x40 rồi chuyển sang vật kính x100 soi dầu.
Chú ý: sau khi quan sát ở vật kính x40, dịch chuyển hơi lệch vị trí vật kính x40, thêm giọt giầu vào tiêu bản, sau đó vặn về vật kính x100. Chỉ có vật kính x100 soi dầu, tránh không để các vật kính khác bị dính dầu. Sau khi quan sát, dùng toluene hoặc axeton để lau vật kính.
2.2. Nhuộm phức tạp.
- Khái niệm: Trên tiêu bản sử dụng đồng thời hai hay nhiều loại thuốc nhuộm.
- Ý nghĩa của phương pháp nhuộm phức tạp:
+ Nhằm nghiên cứu hình thái, cấu trúc đặc biệt của tế bào làm cơ sở cho việc phân loại vi sinh vật.
+ Nhằm phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các tổ chức, cơ quan, của cơ thể động thực vật hay trong các vật phẩm nghiên cứu.
- Nguyên tắc của nhuộm phức tạp:
+ Các cấu trúc khác nhau, thậm chí các phàn khác nhau của một cấu trúc thường có tính chất lý học, hóa học cũng như khả năng bắt màu khác nhau.
+ Việc sử dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta nghiên cứu cấu tạo và đặc tính của tế bào cũng như sự khác nhau giữa các loài vi sinh vật.
- Các phương pháp nhuộm phức tạp thường: nhuộm Gram, nhuộm bào tử, tiên mao, thể ẩn nhập, chất nhân, vỏ nhày,…
Nhuộm gram
- Nguyên tắc:
Người ta cho rằng trong nguyên sinh chất tế bào của một số loài vi sinh vật có chứa phức chất protein đặc biệt mà thành phần của nó có muối ribonucleat magie, khi nhuộm phức chất này kết hợp với loại thuốc nhuộm triphenylmetan (như gential violet, cristal violet, metyl violet...) và iot sẽ cho màu tím rất bền vững chịu được tác dụng của cồn. Những vi sinh vật có tính chất này gọi là vi sinh vật Gram dương (+) nếu không gọi là vi sinh vật Gram âm (-).
Sự khác nhau cơ bản của vi khuẩn gram âm và gram dương là thành tế bào: thành tế bào của vi khuẩn gram dương có lớp peptidoglucan dày (30-50 lớp), thuốc nhuộm đi vào trong tế bào, khi tẩy màu bằng rượu 950 hoặc axeton, nước rút ra khỏi thành tế bào, lớp peptidoglucan co rút lại, màu khó thoát ra à màu khó bị rửa trôi à giữ được màu của thuốc nhuộm đầu; đối với vi khuẩn gram âm thì lớp peptidoglucan mỏng (3-5 lớp), lớp phospholipid kép, giàu lipit, màu thuốc nhuộm dễ bị rửa trôi, nhận biết giữ màu của thuốc nhuộm thứ cấp.
- Các bước tiến hành
Sau khi cố định vết bôi thì tiến hành nhuộm:
+ Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút. + Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên và để trong 1 phút.
+ Rửa nước.
+ Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cho đến khi tan hết màu.
+ Rửa nước.
+ Nhuộm bổ sung Fuchsin trong 1 phút. + Rửa nước.
+ Làm khô tiêu bản và soi dưới vật kính dầu.
III. Thực hành thí nghiệm
1. Nhuộm đơn giản
Trong thí nghiệm nhuộm đơn giản ta thực hiện nhuộm đối với 2 mẫu canh trường trực khuẩn và cầu khuẩn.
B1: chuẩn bị hóa chất, canh trường. khử trùng vị trí làm việc bằng cồn.
Làm tiêu bản của 2 mẫu canh trường trên cùng 1 phiến kính để rút gọn thao tác thí nghiệm. Vết bôi của mỗi mẫu dàn đều đường kính khoảng 1cm2, khoảng cách giữa 2 vết bôi khoảng 1cm.
B2: tạo vết bôi. B3: làm khô vết bôi. B4: cố định vết bôi.
(Các thao tác làm vết bôi nêu ở phần cơ sở lý thuyết 1.2)
B5: nhuộm
(Các thao tác được nêu phần cơ sở lý thuyết 2.1)
B6: quan sát hình thái, màu sắc của vi sinh vật qua kính hiển vi và rút ra nhận xét.
2. Nhuộm gram
B1: chuẩn bị hóa chất, canh trường. khử trùng vị trí làm việc bằng cồn. B2: tạo vết bôi.
B3: làm khô vết bôi. B4: cố định vết bôi.
(Thao tác làm tiêu bản nêu ở phần cơ sở lý thuyết 1.2)
B5: nhuộm màu
(Thao tác nhuộm gram nêu ở phần cơ sở lý thuyết 2.2)
Thứ tự nhuộm màu Gram
(+)
Gram (-) Nhuộm bằng tím tinh thể
Tế bào vi khuẩn chết màng tế bào mất khả năng chọn lọc à thuốc nhuộm đi vào trong tế bào àtế bào có màu thuốc nhuộm.
Xanh
tím Xanh tím Nhuộm bổ sung lugol (I-) à làm bền màu thuốc nhuộm Xanh
tím Xanh tím Tẩy màu bằng cồn. Thời gian khoảng 30s. Vi khuẩn gram (-) lớp
peptidoglucan rất mỏng à khả năng giữ màu kém à màu bị tẩy
à mất màu thuốc nhuộm.
Xanh tím
Không màu Nhuộm màu thức cấp (Fucshin)
Do vi khuẩn gram (-) sau khi tẩy cồn thành không màu nên sẽ tiếp
Xanh tím
nhuộm thứ cấp
B6: quan sát hình thái và màu sắc của vi sinh vật qua kính hiển vi.