M methionine * translation stop
VẼ BẢN ĐỒ PLASMID 1.Mục đích, nguyên tắc
1.Mục đích, nguyên tắc
Plasmid là những đoạn DNA ngắn ( cĩ kích thước khoảng 2-5 kb), dạng vịng, nằm ngồi nhiễm sắc thể, được tìm thấy lần đầu tiên ở vi khuẩn. Sự sao chép plasmid khơng phụ thuộc sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn. Mỗi vi khuẩn cĩ thể chứa hàng trăm plasmid. Plasmid cĩ nhiều đặc tính phù hợp để làm vector trong sự dịng hĩa như:
- Cĩ kích thước nhỏ nên dễ tách ly và thao tác.
- Dạng vịng giúp cho DNA ổn định trong quá trình tách chiết hĩa học.
- Sao chép độc lập với nhiễm sắc thể của tế bào chủ.
- Số bản sao plasmid trong tế bào cĩ thể ít hay rất nhiều.
- Cĩ chứa gen chọn lọc thường là gen kháng kháng sinh giúp cho việc chọn
lọc dịng tế bào mang gen mong muốn một cách nhanh chĩng.
Với các ưu điểm kể trên, plasmid thường được dùng làm vector dịng hĩa và vector biểu hiện gen. Sau quá trình thiết kế vector dịng hĩa hay vector biểu hiện gen, thơng tin về các vector này nhất thiết phải được mơ hình hĩa để tiện cho việc lưu giữ và truyền thơng tin di truyền của plasmid mới thành lập.
Bản đồ plasmid (plasmid map) nhất thiết phải chứa các thơng tin về vị trí các gen quan trọng, vị trí của các enzyme cắt giới hạn cần thiết trên plasmid, promoter, gen chọn lọc… (Hình 12.1.). Như vậy, nhìn vào một bản đồ plasmid chúng ta sẽ biết được những thơng tin cần thiết như tên, chiều dài plasmid, gen chọn lọc (thường là khả năng kháng một loại kháng sinh), plasmid thuộc loại vector biểu hiện hay chỉ cĩ chức năng dịng hĩa…
Cĩ rất nhiều phần mềm chuyên dụng cĩ thể được dùng cho việc thiết lập bản đồ plasmid. Trong chương trình thực tập này, chúng ta cùng làm quen với việc thiết lập bản đồ plasmid với phần mềm Plasdraw.
Hình 12.1. Bản đồ plasmid pICAS1
2.Nội dung thực hành
Sinh viên thực hành thiết lập bản đồ các plasmid với những thơng tin cho sẵn.
3. Thực hành
- Khởi động chương trình Plasdraw bằng cách nhắp đơi vào biểu tượng của chương trình Plasdraw trên màn hình desktop (Hình 12.2.).
Hình 12.2. Biểu tượng của Plasdraw
- Sau khi khởi động chương trình, màn hình hoạt động của Plasdraw mở ra
đợi lệnh.
- Kích hoạt menu tập tin bằng cách nhấn vào nút File trên cửa sổ hoạt động của Plasdraw (Hình 12.3).
Hình 12.3. Cửa sổ hoạt động của plasdraw
- Để thiết lập một bản đồ plasmid mới, trong menu File, chúng ta chọn New. Tiếp theo, điền tên và chiều dài plasmid vào khung Plasmid Parameters (Hình 12.4.). Chọn OK sau khi đã điền đầy đủ thơng tin. Cũng trên cửa sổ Plasmid Parameters người sử dụng cĩ thể lựa chọn dạng biểu diễn của plasmid là dạng thẳng bằng cách chọn khung Linear. Ngược lại, khi chúng ta khơng chọn Linear, mặc nhiên plasmid được biểu diễn ở dạng vịng.
Hình 12.4. Khung Plasmid parameters
Khi đã nhập đủ thơng tin cần cho bước đầu thiết lập một bản đồ plasmid mới, chúng ta sẽ thu được bản đồ sơ bộ của plasmid (Hình 12.5.).
- Để sửa chữa thiết kế lại một bản đồ plasmid đã cĩ, chúng ta nhấn vào nút
Open để mở bản đồ plasmid cĩ sẵn trong tập tin lưu trữ .
- Để nhập các vị trí enzyme cắt giới hạn, chọn menu Restriction sites, nhập tên enzyme cắt giới hạn trong ơ Site Name. Tương tự, nhập vị trí cắt giới hạn của
enzyme này trong ơ Location. Chọn Add site để nhập các dữ liệu này vào bản đồ.
Nhấn OK để hồn tất việc nhập vị trí enzyme cắt giới hạn (Hình 12.6.).
- Sau khi nhập thơng tin, tên của enzyme sẽ được chỉ rõ trên bản đồ plasmid ở vị trí đã chỉ định
- Trường hợp cần thay đổi các vị trí hay tên một enzyme cắt giới hạn đã thiết lập trên bản đồ. Trước hết, chọn tên enzyme cần thay thay đổi. Chọn Delete để xĩa dữ liệu cũ và nhập mới thơng tin về enzyme này.
- Để biểu diễn Multiple Cloning Site (MCS, là một trình tự ngắn gồm tập hợp các vị trí cắt duy nhất của nhiều enzyme cắt giới hạn, giúp cho cĩ nhiều phương án lựa chọn enzyme khi thiết lập vector dịng hĩa hay vector biểu hiện gen), thực hiện các động tác sau:
- Kích hoạt menu Data
- Chọn Multiple cloning site. Cửa sổ hoạt động mang tên Multiple Cloning Site sẽ được mở ra (Hình 12.7.).
- Tiếp theo, lần lượt nhập tên các enzyme cắt giới hạn và vị trí cắt trong
khung Site và khung Start/End.
- Nhấn Enter để nhập dữ liệu. Multiple cloning site sẽ được biểu diễn trên
bản đồ plasmid như Hình 12.8..
- Để biễu diễn vị trí gen trên bản đồ plasmid, thực hiện các bước như sau: Kích hoạt menu Data.
Hình 12.6. Cửa sổ nhập vị trí enzyme cắt giới hạn
- Chọn Genes. Cửa sổ Genes mở ra cho phép người sử dụng nhập các dữ liệu cần thiết (Hình 12.9.).
Hình 12.8. Bản đồ plasmid với Multiple cloning site.
- Ý nghĩa của các chức năng trên cửa sổ là như sau:
Name: nhập tên gen
Start/ End: vị trí khởi đầu và vị trí kết thúc của gen trên bản đồ plasmid
Style/Thickness: chọn kiểu dáng biểu diễn của gen trên bản đồ - Chọn Add gene để xác nhận và chính thức nhập các thơng tin về gen. - Nhấn OK để kết thúc việc thiết kế vị trí một gen trên bản đồ.
- Để thêm (insert fragment) hay xĩa (delete fragment) một gen trên bản đồ plasmid, thực hiện các thao tác sau:
- Kích hoạt menu Data.
- Gọi Insert fragment hay Delete fragment.
- Khi các cửa sổ hoạt động được mở ra (Hình 12.10.), nhập các dữ liệu cần
thiết như vị trí thêm hay xĩa, kích thước đoạn DNA cần thêm vào hay xĩa đi.
- Nhấn OK để thi hành lệnh thêm hay xĩa.
Hình 12.10. Cửa sổ hoạt động insert fragment và delete fragment.
Hình 12.11. Bản đồ một plasmid đã được thiết kế hồn chỉnh.
4. Bài tập
1.Hãy thiết kế bản đồ plasmid PlasI theo những thơng tin sau đây: - PlasI cĩ chiều dài 10765 base pairs (bp);
- Cĩ gen kháng kháng sinh Ampiciline với chiều dài 800bp, cùng chiều kim đồng hồ (clock wise, cw);
- Trình tự khởi đầu sao mã ColE1 ori nằm ở vị trí Nu thứ 3020 tới Nu thứ
3107;
- Gen leu2-d cĩ chiều dài 900bp nằm ở vị trí Nu thứ 5436, cw;
- Multiple Cloning Site kéo dài từ Nu 8828 đến Nu 8884 với vị trí cắt giới
hạn của enzyme BamHI, XmaI và SmaI;
- Lưu bản đồ plasmid vừa thiết kế vào tập tin PlasI trong thư mục mang tên học viên.
2.Plasmid Based-PlasI được thiết kế dựa trên plasmid PlasI bằng cách gắn thêm gen ars1 vào vị trí Nu 65 biết rằng gen ars1 dài 1231bp. Hãy thiết kế bản đồ Based-PlasI và lưu trong tập tin PlasII, thư mục mang tên học viên.
3.Tạo tập tin Dummy trong thư mục mang tên học viên với nội dung là bản đồ
Bài 13.