Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật thực nghiệm

2. Mục tiêu nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật thực nghiệm

2.2.1 Lấy mẫu

- Phương pháp lấy mẫu

Yêu cầu chung: Thực hiện lấy mẫu trên vườn bơ làm thí nghiệm. Chọn 3 hoặc 5 cây bơ có cùng chủng loại, cùng chế đợ chăm sóc, cùng thời điểm chín. Khơng bị thay đổi hình dạng hay cơ lý, hóa học của mẫu.

Thời điểm lấy mẫu: Mẫu được lấy vào thời điểm thu hoạch, tránh thời gian nắng gắt hoặc trời mưa.

Cách lấy mẫu: Theo đường chéo góc hoặc theo đường ziczac theo hình vẽ dưới. Chọn mỗi cây một trái ngẫu nhiên trên vườn với số lượng mỗi mẫu từ 3 - 5 trái.

19 Ghi kí hiệu mẫu như sau:

TA1 - ĐL, Booth 7 - ĐL, TA40 - ĐL, Reed - ĐL, TA - ĐL; TA1 - GL, Booth 7- GL, TA40 - GL, Reed - GL, TA - GL; TA1 - ĐN, Booth 7 - ĐN, TA40 - ĐN, Reed - ĐN, TA - ĐN.

Ghi chú: ĐL: Đắk Lắk; GL: Gia Lai; ĐN: Đắk Nông

Mẫu được chuyển về phịng thí nghiệm. Bảo quản mẫu và để mẫu quả chín ở điều kiện nhiệt đợ bình thường.

2.2.2 Xử lý mẫu

Sau khi quả bơ chín được cắt ra thành 6 phần, mỗi quả lấy 2 phần, lột vỏ cho vào cối sứ, nghiền mịn mang mẫu đi phân tích, phần cịn lại được lưu vào tủ chứa mẫu ở nhiệt độ - 40C. Mẫu được ghi đầy đủ thông tin và bảo quản không bị nhiễm bẩn.

2.2.3 Phương pháp phân tích

+ Xác định hàm lượng chất khô theo TCVN 4326:2007

+ Xác định hàm lượng xơ bằng phương pháp hoà tan mẫu bằng axit và kiềm (Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón và cây trồng (1998), Nhà xuất bản nông nghiệp). + Hàm lượng lipit được tách chiết theo 4 phương pháp như sau

- Phương pháp chiết Soxhlet dầu béo bằng n-hexan

- Phương pháp chiết hỗ trợ sóng siêu âm, gia nhiệt, hồi lưu - Phương pháp chiết gia nhiệt, hồi lưu

- Phương pháp chiết vi sóng: Chúng tơi thực hiện so sánh 4 cách chiết khác nhau sau đó chọn phương pháp tối ưu.

20

* Phương pháp chiết Soxhlet dầu béo bằng n-hexan

Cân 50 gam mẫu bơ đã nghiền mịn sau đó chiết bằng 200 ml n-hexan trong bợ chiết Soxhlet ở nhiệt độ 500C trong 2 giờ. Mẫu được làm lặp lại 3 lần. Dịch chiết thu được đem cất loại dung môi trên máy cất quay chân không ở 400C và áp suất 25 tor. Hàm lượng dầu béo của mẫu bơ sau khi cân trên cân phân tích Sartorius analytic (10-4) và được tính tốn theo phần trăm khối lượng so với mẫu khô ban đầu. Dầu béo thu được được bảo quản trong dung môi n-hexan tinh khiết và lưu giữ ở nhiệt đợ -40C.

* Phương pháp chiết hỗ trợ sóng siêu âm, gia nhiệt, hồi lưu

Cân 50 gam mẫu bơ đã nghiền mịn, sau đó dầu béo được tách ra bởi q trình chiết với 200 mL dung mơi n-Hexan siêu âm ở nhiệt độ 500Ctrong 2 giờ. Mẫu làm lặp lại 3 lần. Hỗn hợp được lọc và dịch chiết thu được đem cất loại dung môi trên máy cất quay chân không ở 400C và áp suất 25 tor. Hàm lượng dầu béo được xác định dựa trên phần trăm khối lượng dầu béo thu được so với khối lượng mẫu khô ban đầu. Dầu béo được lưu giữ ở nhiệt độ -40C.

* Phương pháp chiết gia nhiệt, hồi lưu

Cân 50 g mẫu bơ được nghiền mịn, sau đó dầu béo được tách ra bởi q trình chiết với 200 mL dung mơi n-Hexan ở nhiệt độ 500Ctrong 2 giờ. Mẫu làm lặp lại 3 lần. Hỗn hợp được lọc và dịch chiết thu được đem cất loại dung môi trên máy cất quay chân không ở 400C và áp suất 25 tor. Hàm lượng dầu béo được xác định dựa trên phần trăm khối lượng dầu béo thu được so với khối lượng mẫu khô ban đầu. Dầu béo được lưu giữ ở nhiệt đợ -40C.

* Phương chiết vi sóng

Cân 50 g mẫu bơ được nghiền mịn, sau đó dầu béo được tách ra bởi q trình chiết hỗ trợ vi sóng với 200 mL dung môi n-Hexan ở nhiệt độ 500Ctrong 2 giờ. Mẫu làm lặp lại 3 lần. Hỗn hợp được lọc và dịch chiết thu được đem cất loại dung môi trên máy cất quay chân không ở 400C và áp suất 25 tor. Hàm lượng dầu béo được xác định dựa trên phần trăm khối lượng dầu béo thu được so với khối lượng mẫu khô ban đầu. Dầu béo được lưu giữ ở nhiệt độ -40C.

21

+ Xác định thành phần axit béo cao no và không no, Omega 3, 6, 9 bằng phương pháp GC đầu dò FID (AOAC Official Method 996,06, ban hành lần đầu năm 1996, sửa đổi bổ sung năm 2001 SOP_Case,SK,0107).

Nguyên tắc:

Các acid béo tự do sau khi thủy phân được chiết bằng n-hexane, sau đó cơ quay và được methyl ester hóa (FAMEs) bằng hỗn hợp BF3 trong methanol.

Các FAMEs được phân tích bằng hệ sắc ký khí đầu dị FID, cợt mao quản SP-2560. Kết quả được tính từ phần trăm diện tích của từng FAME trên tổng diện tích các peak FAMEs.

Các phản ứng:

Thuốc thử và vật liệu thử:

n-hexane (TKPT), Ethanol (TKPT), Dung dịch Natri hydroxid 0.5M trong Methanol- NaOH/MeOH 0.5M, Boron trifluoride 14% trong methanol - BF3/MeOH 14% (w/w) Chuẩn methyl ester của 37 chất acid béo (FAMEs) Supecol cho cột SP-2560, chạy cùng điều kiện với COA của nhà sản xuất để nhận danh chính xác thời gian lưu của từng FAME. Dung dịch chuẩn được lưu trữ ở -20 °C trong 12 tháng.

Xử lý mẫu:

- Giai đoạn chiết béo:

Cân 50 gam mẫu bơ đã nghiền mịn sau đó chiết bằng 200 ml n-hexan trong bợ chiết Soxhlet ở nhiệt độ 500C trong 2 giờ. Mẫu được làm lặp lại 3 lần. Dịch chiết thu được

22

đem cất loại dung môi trên máy cất quay chân không ở 400C và áp suất 25 tor. Hàm lượng dầu béo của mẫu bơ sau khi cân trên cân phân tích Sartorius analytic (10-4) và được tính tốn theo phần trăm khối lượng so với mẫu khô ban đầu. Dầu béo thu được được bảo quản trong dung môi n-hexan tinh khiết và lưu giữ ở nhiệt đợ -40C.

- Giai đoạn methyl ester hố:

Chuyển dịch béo sau khi cơ quay vào bình cầu 50.0 ml, thêm 4.0 ml dung dịch NaOH 0.5M/ MeOH, đun nóng trong 15 phút ở 100°C, thêm 4.0 ml dung dịch BF3 14%/MeOH, tiếp tục đun trong 30 phút. Thêm 4,0 ml n-hexane vào bình cầu, lắc kĩ trong 30 giây. Thêm 10,0 ml dung dịch NaCl bão hoà,1 g Na2CO3, lắc đều đến khi hết bọt khí bay lên. Thêm nước muối bão hồ đến cổ bình cầu, rút lớp n-hexane vào mợt ống nghiệm có chứa sẵn muối Na2SO4, để làm khan. Chuyển phần dịch trong vào vial 1.5 ml và tiến hành phân tích trên hệ GC-FID.

Hỗn hợp chuẩn 37 chất FAMEs được dùng để xác định thời gian lưu của các acid béo (đã được chuyển thành các hợp chất FAME sau quá trình tạo dẫn xuất).

Điều kiện phân tích:

- Cợt phân tích: SP-2560 (100 m x 0.25 mm x 0.2 μm). - Nhiệt độ injector: 250°C.

- Nhiệt độ detector: 260°C.

- Tổng chương trình nhiệt: 60 phút. - Tỉ lệ chia dịng: 1/25.

- Tốc đợ dịng pha đợng (khí H2): 40.0 ml/phút. - Tốc đợ dịng khí mang: 400.0 ml/phút.

- Tốc đợ dịng khí bổ trợ (N2/khơng khí): 30.0 ml/phút Tính kết quả: Thành phần acid béo:

C = S /ΣS acid béo i *F

23 S acid béo i : Diện tích acid béo i

ΣS acid béo: Tổng diện tích các acid béo trên sắc kí đồ thu được F : Hàm lượng béo tổng

Tính hàm lượng mợt số chỉ tiêu liên quan:

- Béo bão hồ / béo khơng bão hồ đơn / béo khơng bão hồ đa:

Béo bão hồ (SFA): trong cơng thức cấu tạo của các acid béo có mạch hydrocarbon gồm các nguyên tử C liên kết với nhau bằng các nối đơn.

Béo khơng bão hồ đơn (MUFA): trong cơng thức cấu tạo của các acid béo có mạch hydrocarbon gồm các nguyên tử C liên kết với nhau bằng các nối đơn và một nối đôi. Béo không bão hồ đa (PUFA): trong cơng thức cấu tạo của các acid béo có mạch hydrocarbon gồm các nguyên tử C liên kết với nhau bằng các nối đơn và hai nối đôi trở lên.

C SFA/MUFA/FUFA = Σ S SFA/MUFA/PUFA/Σ S acid béo *F

Với: C SFA/MUFA/FUFA : lần lượt là hàm lượng của acid béo bão hồ/khơng bão hồ

đơn/đa

Σ S SFA/MUFA/PUFA: Tổng diện tích peak các acid béo bão hồ/khơng bão hồ đơn/ đa. - Hàm lượng omega 3 / omega 6 / omega 9:

C Omega 3 = ΣS ALA+DHA+EPA/ΣS acid béo *F C Omega 6 = ΣS GLA+LA+ARA/ΣS acid béo *F C Omega 9 = ΣS C18:1+C20:1+C22:1/ΣS acid béo *F

Với: C Omega 3,6,9 : lần lượt là hàm lượng omega 3,6,9

- Luận văn áp dụng các phương pháp ở trên để tiến hành làm thực nghiệm. - Dùng phần mềm Anova và SPSS 16.0 để xử lý số liệu

2.3 Hóa chất và dụng cụ thực nghiệm

24

− Chuẩn methyl ester của 37 chất acid béo (FAMEs) Supecol cho cột SP-2560, chạy cùng điều kiện với COA của nhà sản xuất để nhận danh chính xác thời gian lưu của từng FAMEs. Dung dịch chuẩn được lưu trữ ở -20 °C trong 12 tháng.

− Cân phân tích, có đợ chính xác đến ± 0,0001 g; − Bộ chiết Soxlet

− Tủ sấy − Bếp điện − Lị vi sóng

− Nồi cách thủy sóng siêu âm

− Máy sắc ký khí GC-FID GC-2010 Plus − Các dụng cụ trong phịng thí nghiệm

25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả phân tích hàm lượng chất khô, xơ và lipit trong các giống bơ

Về tiêu chuẩn chọn tạo giống bơ, bắt đầu từ năm 1995 các nhà khoa học và xuất nhập khẩu bơ trên thế giới đã nghiên cứu và thống nhất đưa ra được tiêu chuẩn xuất khẩu bơ gọi tắt là CODEX STAN 197-1995, trong đó đã đưa ra rất nhiều tiêu chí cụ thể về hình dạng, kích cỡ quả, u cầu về đợ chín, phân hạng và chất lượng quả bơ. Cụ thể có 2 chỉ tiêu chọn lọc đặc biệt quan trọng cần đạt là hàm lượng chất khô phải đạt tối thiểu từ 20 - 21% trở lên, hàm lượng lipit trên 12%. Các giống bơ được xác định làm chuẩn và xuất khẩu chính là Hass, Ettinger và Zutano [23].

Hiện tại có rất nhiều giống bơ được sản xuất gồm các dòng, cây đầu dòng địa phương và các giống nhập nợi nhưng trong số đó có 02 giống bơ TA1, TA40 trong nước và 02 giống bơ thương mại nhập nội Booth 7, Reed đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nơng thơn cơng nhận giống mới chính thức năm 2016 [13] [24], đã được đưa vào sản xuất và trồng với quy mô lớn tại 03 tỉnh Đắk Lắk, Đắk Nông và Gia Lai với hàm lượng các chất dinh dưỡng cụ thể như sau:

3.1.1 Hàm lượng chất khô

Hàm lượng chất khô được đánh giá bằng phương pháp sấy khơ theo TCVN 4326:2007. Quy trình được thực hiện như sau:

Cân chính xác 30 - 50 gam mẫu tươi (m1) cho vào đĩa petri đã biết trước khối lượng (m2). Đặt mẫu vào tủ sấy, tăng dần nhiệt đợ lên đến 105oC, duy trì nhiệt đợ 6-8 giờ. Lấy mẫu ra để ng̣i trong bình hút ẩm. Tiếp tục cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 0C khoảng 1 - 2 giờ, lấy ra để ng̣i trong bình hút ẩm, cân trọng lượng đến khi chênh lệch giữa 2 lần sấy không quá ±0,001 g (m3). Tính kết quả

Chất khơ = ((m3 – m2)/m1)*100(%)

26

Hình 3.1 Biểu đồ hàm lượng chất khơ mợt số giống bơ tại Tây Nguyên Kết quả trên biểu đồ 3.1 cho thấy:

Hàm lượng chất khô trong quả bơ của các giống có sự sai khác có ý nghĩa thống kê, trong đó giống TA1 có hàm lượng chất khơ cao nhất đạt đến 26,94%, kế đến là giống TA40 (25,66%) và thấp nhất là giống Booth 7 (23,55%).

Như vậy, dựa vào kết quả phân tích cho thấy tất cả các giống đều có hàm lượng chất khơ cao và đặc biệt là giống TA1 có hàm lượng chất khơ cao nhất, điều này chứng tỏ giống TA đạt chất lượng tốt nhất.

3.1.2 Hàm lượng lipit

Hàm lượng lipit của mẫu được xác định bằng phương pháp Soxlet, kết quả nghiên cứu được thể hiện ở biểu đồ sau:

26.94 25.66 23.55 23.71 21 22 23 24 25 26 27 28

TA1 TA40 Booth 7 Reed

27

Hình 3.2 Biểu đồ hàm lượng lipit một số giống bơ tại Tây Nguyên

Hàm lượng lipit của các giống là khác biệt có ý nghĩa thống kê, giống TA40 có hàm lượng lipit cao nhất (19,11%) và thấp nhất là giống TA1 (12,99%).

Đối với mẫu bơ, chỉ tiêu lipit là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng và giá trị về mặt dinh dưỡng. Hàm lượng lipit trong quả bơ cao thì thành phần axit béo cao no và khơng no, omega 3, 6, 9 sẽ cao.

3.3.3 Hàm lượng chất xơ

Hàm lượng chất xơ được phân tích bằng phương pháp hòa tan mẫu bằng axit và kiềm. Quy trình được thực hiện như sau:

Cân 2g mẫu (m1) đã sấy khô ở 105 0C cho vào cốc thuỷ tinh, thêm vào 50 ml H2SO4 8% và 50 ml nước đun sơi 10 phút. Rửa gạn với nước nóng nhiều lần. Thêm 100 ml nước và 9 ml NaOH 30% đun sôi 10 phút. rửa gạn nhiều lần với nước nóng. Chuyển tồn bợ cặn lên phễu có giấy lọc đã biết trước trọng lượng (m2).

Sau đó lấy giấy lọc có chứa cặn, sấy cặn ở 105 0C trong vòng 5 - 6 giờ. Lấy ra để ng̣i trong bình hút ẩm, cân trọng lượng rồi tiếp tục cho vào sấy 1 - 2 giờ ở nhiệt đợ 105 0C, lấy ra để ng̣i trong bình hút ẩm, cân trọng lượng đến khi chênh lệch giữa 2 lần sấy khơng q ±0,001 g (m3). Tính kết quả.

Xơ = ((m3 – m2)/m1)*100(%)

Kết quả nghiên cứu được thể hiện ở biểu đồ sau:

Hàm lượng lipid (%) 12.99 19.11 13.89 16.91 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

TA1 TA40 Booth 7 Reed

28

Hình 3.3 Biểu đồ hàm lượng chất xơ một số giống bơ tại Tây Nguyên

Hàm lượng chất xơ là chỉ tiêu đánh giá chất lượng quả bơ, nếu hàm lượng càng cao thì chất lượng quả bơ càng thấp. Nếu hàm lượng cao thì quả bơ thường có những sợi xơ trong thịt hay gọi là "chạy chỉ" sẽ làm giảm giá trị sản phẩm, ăn khơng ngon. Kết quả phân tích hàm lượng chất xơ của các giống thể hiện ở Biểu đồ 3.3 có thể thấy rằng giống TA40, TA1 có nhiều xơ hơn giống Booth 7 và Reed. Đây là một hạn chế của giống TA1 và TA40.

3.2 Kết quả khảo sát các điều kiện tối ưu thiết lập quy trình xác định hàm lượng axit béo, omega 3, 6, 9

3.2.1 Khảo sát các điều kiện tối ưu của phương pháp chiết

Để phân tích được thành phần axit béo cao no, khơng no và omega 3, 6, 9 thì việc tách chiết chất béo là mợt bước rất quan trọng. Để lựa chọn được phương pháp tách chiết phù hợp với mẫu cần phân tích và phù hợp với điều kiện thực tế, đề tài đã thực hiện 4 phương pháp tách chiết là: Soxhlet, vi sóng, gia nhiệt và sóng siêu âm.

Hàm lượng Chất xơ (%) 2.49 2.26 1.48 1.54 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

TA1 TA40 Booth 7 Reed

29

Chú giải: Các phương pháp chiết được thực hiện trên một nền mẫu bơ Booth 7. Kết quả lặp lại 3 lần.

Kết quả thực nghiệm của các phương pháp tách chiết béo được thể hiện ở Bảng 3.1 Bảng 3.1 Hàm lượng chất béo của các phương pháp chiết

Phương pháp Hàm lượng béo

Soxhlet 13,89%

Siêu âm 13,54%

Gia nhiệt 11,80%

Vi sóng 13,38%

Dựa vào Bảng 3.1 ta thấy trong 4 phương pháp chiết ở trên thì phương pháp chiết bằng Soxhlet là cao nhất là 13,89%, phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm là 13,54%, phương pháp vi sóng là 13,38%, gia nhiệt hồi lưu cho kết quả thấp nhất là 11,80%. Tuy nhiên cả 4 phương pháp khơng có khác biệt về ý nghĩa thống kê. Để thuận lợi, đề tài sẽ lựa chọn phương pháp chiết Soxhlet vì phù hợp với điều kiện làm thí nghiệm