CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2.9.Đánh giá tính chất lý hóa của proteintinh sạch
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.9.Đánh giá tính chất lý hóa của proteintinh sạch
2.2.9.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm
Protein kháng nấm sau khi tinh sạch qua cột Biogel P100 đem đi sốc nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau nhƣ: 40o
C, 50oC, 60oC, 80oC, trong thời gian 30 phút. Dịch protein sau khi sốc nhiệt đƣợc bổ sung 20 µl vào khoanh giấy lọc, mẫu đối chứng là 20 µl đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8. Các khoanh giấy đƣợc đặt vào đĩa thạch nuôi cấy các chủng nấm F. oxyporum và
nấm R. solani sau 3- 5 ngày kiểm tra khả năng ức chế sinh trƣởng của nấm.
2.2.9.2. Ảnh hưởng của Proteinase K lên hoạt tính kháng nấm
Dịch protein sau khi tinh sạch đƣợc bổ sung proteinase K vào ở các nồng độ khác nhau nhƣ: 0,5; 1; 2; 2,5; 4; 5 µg, mẫu đối chứng là 20 µl µM/L K2HPO4, KH2PO4, pH 6,8. Sau khi đƣợc xử lý với proteinase K thì dịch protein đƣợc bổ sung 20 µl vào các khoanh giấy lọc đƣợc đặt vào đĩa nuôi cấy chủng nấm F. oxyporum và nấm R. solaniđặt vào tủ 28o
C nuôi sau 3- 5 ngày kiểm tra khả năng ức chế sinh trƣởng của nấm.
2.2.9.3. Khả năng ức chế của protein lên sợi bào tử nấm
- Mẫu thí nghiệm: Cho dịch protein vào ống eppendorf 80 µl thêm 80 µl 0,2% glucose và bổ sung thêm 40 µl nấm F. oxyporum trộn đều trong ống eppendorf .
- Mẫu đối chứng: làm tƣơng tự nhƣng thay dịch protein bằng đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8.
Sau đó hút 100 l mẫu thí nghiệm và 100 µl mẫu đối chứng cho vào 2 ống eppendorf ủ ở nhiệt độ 28 – 30oC theo dõi quan sát sự nảy mầm của bào tử nấm trên kính hiển vi điện tử 24 giờ đến 48 giờ.
2.2.9.4. Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein với nấm R. solani và F. oxysporum
Protein tinh sạch có khối lƣợng phân tử là 45 kDa đƣợc tập trung lại để thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với nấm F. oxysporum và R. solani bằng phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung. Đặt đĩa nấm vào tủ 28oC nuôi 3-5 ngày kiểm tra đo đƣờng kính ức chế sinh trƣởng nấm.