CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2.3.Thử hoạt tính kháng nấm bằng khoanh giấy lọc
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.3.Thử hoạt tính kháng nấm bằng khoanh giấy lọc
Bổ sung 10 ml môi trƣờng PDA có bổ sung 0,1% ampicillin đổ vào đĩa petri để ráo mặt thạch, đặt nấm thử nghiệm vào giữa đĩa. Sau đó đặt các khoanh giấy lọc có đƣờng kính 0,5 cm vào đĩa thạch. Tiếp theo hút 20µl protein tinh sạch nhỏ vào các khoanh giấy lọc, đặt đĩa vào tủ nuôi 300C ủ trong 3 ngày đến 5 ngày kiểm tra, mẫu đối chứng âm là đệm potasium photphate 20 mM, pH 6,8.
2.2.4. Phương pháp tủa muối amonium sulfate
Cơ sở của phƣơng pháp này là dựa vào sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein ở một nồng độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão hòa) để loại bỏ bƣớc đầu protein tạp trong dịch protein thô ban đầu. Các loại muối có thể đƣợc dùng là muối (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 nhƣng muối tốt nhất là muối (NH4)2SO4 vì nó không làm hại mà còn có tác dụng làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein. Hơn nữa chi phí cho loại muối này thấp và phổ biến. Độ hòa tan của nó rất lớn (bão hòa 767 g/l ở 250C).
Dịch protein thô đƣợc tủa muối amonium sulfate ở các nồng độ bão hòa lần lƣợt là 30% và 70%. Các bƣớc tủa và ly tâm đƣợc thực hiện ở 40C.
Sau khi tủa amonium sulfate 70% ly tâm thu tủa protein, tủa này đƣợc hòa trong đệm potasium phosphate 20 mM, pH6,8 và đƣợc thẩm tích để loại muối. Sau khi đã thẩm tích loại muối thì tiếp tục cho lên cột DEAE-cellulose tinh sạch.
2.2.5. Phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose
Phƣơng pháp này là dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein, hay phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nƣớc hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion ở đây là DEAE (diethylaminoethyl) cellulose mang điện tích dƣơng.
Trong hỗn hợp protein với dung dịch đệm có pH tƣơng ứng, các protein sẽ trở nên tích điện. Các protein mang điện tích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại và bám trên cột sắc ký. Sau đó, dùng dung dịch đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8 chứa NaCl 1M để đẩy protein ra khỏi chất trao đổi ion.
Gel DEAE-cellulose đã đƣợc hoạt hóa sẵn đƣợc nhồi vào cột có kích thƣớc (2,6 x 60) cm, rửa và cân bằng cột trong đệm potasium phosphate 20 mM pH 6,8 có chứa 0,1 M NaCl. Protein sau khi tủa muối đƣợc đƣa lên cột và đẩy ra bằng đệm potasium phosphate 20 mM; pH 6,8 có chứa 1 M NaCl, tốc độ dòng chảy 25ml/giờ. Thu 30 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 1,5ml. Hàm lƣợng protein đƣợc xác định cho mỗi phân đoạn, lựa chọn các phân đoạn có hàm lƣợng protein cao và xác định hoạt tính kháng nấm. Các phân đoạn có hoạt tính kháng nấm cao nhất sẽ đƣợc tập trung lại để đƣa lên cột Biogel P100 tinh sạch.
2.2.6. Phương pháp sắc ký lọc gel Biogel P100
Phƣơng pháp lọc gel là một trong những ký thuật sắc ký cột đƣợc dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein. Cơ sở của phƣơng pháp lọc gel là dựa sự khác nhau về kích thƣớc, hình dạng phân tử lƣợng của protein có trong hỗn hợp. Biogel P100 là một polyacrylamide trong đó phân tử của chúng liên kết với nhau bởi các liên kết ngang tạo thành sàng phân tử bởi hệ thống lỗ lƣới xốp.
Các phân đoạn có hoạt tính kháng nấm mạnh sau khi qua cột DEAE – celulose có hoạt tính kháng nấm mạnh tiếp tục đƣợc đƣa lên cột Biogel P100. Cột có kích thƣớc (2,6x60) cm đƣợc cân bằng với đệm 20 mM potasium phosphate pH 6,8. Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml.
Quá trình tách chiết và tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm đƣợc tóm tắt theo sơ đồ hình 2.1
Hình 2.1. Quy trình tinh sạch protein kháng nấm từ chủng B. subtilis AS
Dịch lên men Dịch nổi Tủa muối amonium sulfate 30% Li tâm 12000 vòng/20 phút thu tủa
Tủa muối amonium sulfate 70%
Li tâm 12000 vòng/15 phút thu dịch
Tinh sạch qua cột Biogel P100
Tinh sạch qua cột DEAE
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút. Dich sau lên men đƣợc lọc qua màng lọc minispore 0,2 µm
Tủa đƣợc hòa vào đệm potasium phophate 20 mM,Xác định hàm lƣợng protein Thử hoạt tính kháng nấm F. oxyporum và R. solani - Thử hoạt tính kháng nấm F. oxysporum và R. solani
- Kiểm tra điện di SDS- PAGE của protein tinh sạch. - Xác định hàm lƣợng protein - Đánh giá tính chất lí hóa của hoạt chất tinh sạch.
Rửa cân bằng cột bằng dung dịch đệm potasium phophate 20 mM có chứa 0,1 M NaCl. Đƣa 5 ml dịch lên cột, thu dịch protein bằng đệm trên có chứa 1 M NaCl Xác định hàm lƣợng protein; Thử hoạt tính kháng nấm F. oxyporum và R. solani Xác định hàm lƣợng protein; Thử hoạt tính kháng nấm F. oxyporum và R. solani Protein tinh sạch Xác định hàm lƣợng protein
Rửa cân bằng cột bằng dung dịch đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8. Đƣa 5 ml dịch lên cột. Dùng đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8 để thu 20 phân đoạn protein mỗi phân đoạn 1 ml.
2.2.7. Xác định hàm lượng protein tổng số
Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford (1976) [15], dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu xanh có khả năng hấp phụ ánh sáng mạnh nhất ở bƣớc sóng 595 nm, cƣờng độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch.
Hàm lƣợng protein tổng số đƣợc xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò 1 mg/ml (Hình 2.3).
Hình 2.2. Đƣờng chuẩn Brardford
2.2.8. Điện di SDS - PAGE
Điện di protein trên gel polyacrylamide 12,5 % theo Laemmli (1970) [32], Sự phân tách các protein bằng điện di gel polyacrylamide SDS (SDS- PAGE) không phải dựa vào sự tích điện bên trong của các polipeptide mà dựa vào khối lƣợng phân tử. Sodium dodecysulfate (SDS) là một chất hoạt tính bề mặt có điện tích âm (anion), làm biến tính protein bằng cách bao phủ xung quanh polypeptide chính của phân tử protein. Trong điện di protein, SDS sẽ cung cấp một mạng lƣới điện tích âm dọc suốt theo chiều dài polypeptide. Nhƣ vậy với sự có mặt của SDS và một yếu tố khử, các
y = 3.2213x + 0.0275 R² = 0.9919 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 0.05 0.1 0.15 0.2 OD (5 95 nm ) Hàm lƣợng BSA (mg/ml)
polypeptide trở nên duỗi thẳng và tích điện âm. Khi điện di, dƣới tác dụng của dòng điện một chiều các phân tử protein tích điện âm sẽ di chuyển đến cực dƣơng và đƣợc phân tách thành các băng khác nhau theo khối lƣợng của mỗi phân tử. Thành phần gel điện di đƣợc thể hiện nhƣ (Bảng 2.4).
Bảng 2.4. Thành phần gel cô và gel tách
Thành phần Gel tách (µl) Gel cô (µl)
H2O 1940 1180 Dung dịch A 1500 0 Dung dịch B 0 500 Dung dịch C 2500 300 SDS 10% 60 20 Ammonium persulfate 10% 24 10 TEMED 7 5 Tổng 6031 2015 Quy trình nhuộm bạc:
Bản gel đƣợc rửa trong 100 ml dung dịch 1 (50% (v/v) methanol, 5% (v/v) acetic acid, 50 µl formaldehyde), lắc trong 20 phút. Sau đó rửa lại trong 100 ml dung dịch 2 (50% (v/v) methanol) trong 10 phút. Tiếp tục rửa trong 100 ml nƣớc cất trong 10 phút. Bản gel ngâm trong 100 ml dung dịch 3 (0,02% Na2S2O3) trong 1 phút. Sau đó rửa bằng 100 ml nƣớc cất trong 1 phút. Nhuộm bản gel bằng cách lắc trong 50 ml dung dịch 4 (1% AgNO3) trong tối 20 phút. Rửa bằng nƣớc cất trong 1 phút. Cuối cùng thực hiện phản ứng hiện màu bằng 100 ml dung dịch 5 (2% Na2CO3 + 50µl formaldehyde) đến khi hiện băng, phản ứng đƣợc dừng bằng dung dịch 6 (5% acid acetic) [13].
2.2.9. Đánh giá tính chất lý hóa của protein tinh sạch
2.2.9.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính kháng nấm
Protein kháng nấm sau khi tinh sạch qua cột Biogel P100 đem đi sốc nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau nhƣ: 40o
C, 50oC, 60oC, 80oC, trong thời gian 30 phút. Dịch protein sau khi sốc nhiệt đƣợc bổ sung 20 µl vào khoanh giấy lọc, mẫu đối chứng là 20 µl đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8. Các khoanh giấy đƣợc đặt vào đĩa thạch nuôi cấy các chủng nấm F. oxyporum và
nấm R. solani sau 3- 5 ngày kiểm tra khả năng ức chế sinh trƣởng của nấm.
2.2.9.2. Ảnh hưởng của Proteinase K lên hoạt tính kháng nấm
Dịch protein sau khi tinh sạch đƣợc bổ sung proteinase K vào ở các nồng độ khác nhau nhƣ: 0,5; 1; 2; 2,5; 4; 5 µg, mẫu đối chứng là 20 µl µM/L K2HPO4, KH2PO4, pH 6,8. Sau khi đƣợc xử lý với proteinase K thì dịch protein đƣợc bổ sung 20 µl vào các khoanh giấy lọc đƣợc đặt vào đĩa nuôi cấy chủng nấm F. oxyporum và nấm R. solaniđặt vào tủ 28o
C nuôi sau 3- 5 ngày kiểm tra khả năng ức chế sinh trƣởng của nấm.
2.2.9.3. Khả năng ức chế của protein lên sợi bào tử nấm
- Mẫu thí nghiệm: Cho dịch protein vào ống eppendorf 80 µl thêm 80 µl 0,2% glucose và bổ sung thêm 40 µl nấm F. oxyporum trộn đều trong ống eppendorf .
- Mẫu đối chứng: làm tƣơng tự nhƣng thay dịch protein bằng đệm potasium photphate 20 mM pH 6,8.
Sau đó hút 100 l mẫu thí nghiệm và 100 µl mẫu đối chứng cho vào 2 ống eppendorf ủ ở nhiệt độ 28 – 30oC theo dõi quan sát sự nảy mầm của bào tử nấm trên kính hiển vi điện tử 24 giờ đến 48 giờ.
2.2.9.4. Hoạt tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của protein với nấm R. solani và F. oxysporum
Protein tinh sạch có khối lƣợng phân tử là 45 kDa đƣợc tập trung lại để thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với nấm F. oxysporum và R. solani bằng phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung. Đặt đĩa nấm vào tủ 28oC nuôi 3-5 ngày kiểm tra đo đƣờng kính ức chế sinh trƣởng nấm.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS
Chủng B. subtilis AS đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng NYD và nuôi lắc
trong bình tam giác 1000 ml chứa 250 ml môi trƣờng NYD ở điều kiện 37o C, 200 vòng/phút thời gian lên men 5 ngày. Dịch lên men chủng B. subtilis AS đƣợc li tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi, dịch li tâm đƣợc lọc qua màng lọc minisart 0,20 µm, thu dịch lọc vô khuẩn. Dịch lọc ngoại bào đƣợc tiến hành thử hoạt tính ức chế nấm F. oxysporum và R. solani theo
phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung.
3.1.1. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm F. oxysporum
Khi đánh giá sự tác động của dịch lọc tế bào với nồng độ khác nhau lên sự sinh trƣởng và phát triển của nấm F. oxyporum (Hình 3.1 và Bảng 3.1). Trên môi trƣờng PDA chứa 10%, 20%, 30% và 50% dịch lọc ngoại bào B. subtilis AS, nấm F. oxysporum bị ức chế phát triển, sợi nấm thay đổi màu so với nồng độ thử. Cụ thể ở nồng độ 10% dịch lọc tế bào chủng B. subtilis AS có thể bị ức chế 35% sự sinh trƣởng của nấm F. oxysporum trong thời gian 5 ngày. Tuy
nhiên ở những nồng độ cao hơn, dịch lọc tế bào chủng B. subtilis AS thể hiện tác động lớn tới hoạt tính ức chế sinh trƣởng nấm. Cụ thể ở nồng độ 20% với nấm F. oxysporum bị ức chế 67%, ở nồng độ 50% nấm F. oxysporum bị ức chế đến 93%, sợi nấm mất hình thái thông thƣờng và bị đổ xẹp.
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh trƣởng của F. oxysporum Nồng độ dịch lọc (%) Sinh trƣởng nấm (Ø : cm) Hoạt tính ức chế (%)
Hình thái sợi nấm, đặc điểm phát triển
0 9 0 Sợi bông màu tím nhạt
10 7,25 ± 0,35 35 ± 6,33 Sợi bông màu tím nhạt
20 5,15 ± 0,21 67 ± 2,70 Sợi bông màu trắng hồng nhạt 30 3,2 ± 0,28 87 ± 2,23 Sợi bông màu trắng hồng nhạt 50 2,4 ± 0,14 93 ± 0,84 Sợi bông tàn lụi
Đ/C 10% Đ/C 20%
Đ/C 30% Đ/C 50%
Hình 3.1.Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối với nấm
3.1.2. Hoạt tính ức chế của dịch lọc ngoại bào đối với nấm R. solani
Đánh giá sự tác động của dịch lọc tế bào với nồng độ khác nhau lên khả năng sinh trƣởng và phát triển của nấm R. solani (Hình 3.2 và Bảng 3.2), Trên môi trƣờng PDA chứa 10%, 20%, 30% dịch lọc tế bào chủng B. subtilis AS, nấm R. solani đã bị ức chế khả năng sinh trƣởng và phát triển. Ở nồng độ
10% sau 2 ngày ức chế 32%. Tuy nhiên ở nồng độ cao hơn, dịch lọc tế bào của chủng B. subtilis AS thể hiện sự tác động khác biệt khá rõ rệt đến hoạt tính ức chế sinh trƣởng nấm. Cụ thể ở nồng độ 20% với nấm R. solani đã ức chế đƣợc 61%. Ở nồng độ 50% nấm R. solani bị ức chế đến 95% và có dấu
hiệu tàn lụi từ ngày thứ 4.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch lọc tế bào B. subtilis AS lên sinh trƣởng của
nấm R. solani Nồng độ dịch lọc (%) Sinhtrƣởng nấm (Ø : cm) Hoạt tính ức chế (%) Hình thái sợi nấm, đặc điểm phát triển
0 9 0 Sợi bông, màu trắng nâu
10 7,4 ± 0,14 32 ± 2,58 Sợi bông, màu trắng nâu
20 5,6 ± 0,21 61 ± 2,96 Sợi bông, màu nâu nhạt
30 4,3 ± 0,21 77 ± 2,28 Sợi bông, màu trắng
Đ/C 10% Đ/C 20%
Đ/C 30% Đ/C 50%
Hình 3.2.Hoạt tính ức chế nấm của dịch lọc ngoại bào chủng B. subtilis AS đối với
nấm R. solani sau 3 ngày.
Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới. Rezuanul và cộng sự (2012) đã nghiên cứu dịch lọc ngoại bào của chủng B. subtilis C9 có khả năng ức chế sự phát triển của nấm F.oxysporum ở nồng độ 2 mg/ml đạt 63,8% và ức chế sự phát triển của nấm R.solani đƣợc
32,3% ở nồng độ 2mg/ml [53].
Nghiên cứu mới đây nhất của Ali và cộng sự (2014) khi nghiên cứu về chủng Bacillus sp. RMB7 cho thấy dịch lọc có khả năng ức chế > 70% sự sinh trƣởng và phát triển của nấm R. solani [11].
Từ những số liệu thu đƣợc cho thấy chủng B. subtilis AS có tiềm năng lớn cho nghiên cứu phát triển phòng và chống nấm bệnh cây trồng đối với nấm F. oxysporum và R. solani .
Từ kết quả trên chúng tôi tiếp tục tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm bằng cách tủa amonium sulfate 30%; amonium sulfate 70%, tinh sạch qua
cột sắc ký trao đổi ion DEAE; sắc ký lọc gel Biogel P100 để nhằm tạo ra protein có độ tinh sạch cao đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát bệnh hại cây trồng. Quá trình tinh sạch các hoạt chất kháng nấm từ chủng B. subtilis AS đƣợc tiến hành dựa theo phƣơng pháp của Li và cộng sự có sự cải tiến [37].
3.2. Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm
3.2.1. Tủa protein bằng muối amonium sulfate
Protein đƣợc tủa bằng muối amonium sulfate ở các nồng độ muối là 30% và 70%. Dịch protein đƣợc tủa muối amonium sulfate bão hòa ở nồng độ 30%. Hòa tan muối từ từ vào dung dịch protein và khuấy nhẹ trong 1 giờ ở 40C. Dịch sau khi tủa muối đƣợc ly tâm 12000 vòng/ 15 phút, thu dịch trong.
Dịch protein thô này đƣợc tiếp tục tủa muối amonium sulfate ở nồng độ 70%, hòa tan muối từ từ vào dịch protein trong khoảng 1 giờ ở 40C, bảo quản ở 40Cqua đêm, ly tâm 12000 vòng/20 phút thu tủa. Tủa thu đƣợc hòa vào trong đệm potasium phosphate 20 mM pH6,8 và thẩm tích trong vòng 24 giờ để loại muối amonium sulfate, sau đó dịch protein tiếp tục tinh sạch bằng sắc ký cột.
3.2.1. Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE – cellulose
Tổng thể tích là 5 ml dịch protein sau khi thẩm tích (hàm lƣợng protein đạt 2,98 mg/ml) đƣa lên cột sắc ký trao đổi ion DEAE – celulose, sử dụng đệm potasium photphate 20 mM có chứa 1 NaCl để đẩy protein ra khỏi cột. Chúng tôi thu đƣợc 30 phân đoạn mỗi phân đoạn 1,5 ml, các phân đoạn này sẽ đƣợc đo hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp Braford. Kết quả trên sắc ký đồ cho thấy hàm lƣợng protein sau khi qua cột DEAE – celulose tập trung cao ở các phân đoạn 7 đến 15 và có một đỉnh cao nhất ở phân đoạn 10 hàm lƣợng protein đạt đƣợc 2,75 mg/ml (Hình 3.3).
Các phân đoạn tinh sạch