Tinh trùng sau khi được thu nhận sẽ được lọc rửa, chọn một tinh trùng di động trong môi trường và thực hiện bất động tinh trùng bằng cách dùng kim tiêm chà vào đuôi tinh trùng hoặc hút nhả vài lần. Thao tác này sẽ làm tổn thương màng tinh trùng giúp cho việc giải phóng các yếu tố của tinh trùng vào bào tương noãn dễ dàng hơn [1]. Các yếu tố tinh trùng chủ yếu là những protein nhạy cảm với nhiệt độ và chỉ có hiệu quả sinh học khi tinh trùng đã được tiêm vào bào tương noãn. Sau khi tinh trùng được tiêm vào noãn, trong noãn có sự gia tăng nồng độ Ca2+ nhờ vào sự phóng thích các nguồn dự trữ Ca2+ từ lưới nội chất, với vị trí gia
tăng đầu tiên là điểm tinh trùng xâm nhập. Sự thay đổi nồng độ nồng độ Ca2+
thành các đợt sóng dao động Ca2+ được kích hoạt bởi inositol trisphosphate (IP3) nhờ các enzyme phospholipase C đặc hiệu hiện diện ở phần vỏ xung quanh nhân tinh trùng (cơ chế chất truyền tin thứ hai) [24], [25]. Theo con đường truyền tín hiệu nội bào này, noãn sẽ được hoạt hóa và hình thành một loạt phản ứng sinh hóa trong bào tương noãn. Kết quả là nhân tinh trùng được giải nén, hình thành tiền nhân và đẩy thể cực thứ hai ra khoang quanh noãn. Tiền nhân đực và tiền nhân cái tiến lại gần nhau, phân chia và tạo thành hợp tử. Sau đó, hợp tử tiếp tục phát triển tạo thành phôi trước khi được chuyển vào tử cung người mẹ.
Đánh giả kết quả sau khi tiến hành ICSI
Đánh giá kết quả thụ tinh[3]
Noãn được xem là thụ tinh bình thường khi xuất hiện 2 tiền nhân: một tiền nhân đực và một tiền nhân cái. Thông thường, cả hai tiền nhân xuất hiện cùng thời gian trong khoảng 17 ± 1 giờ sau khi tiến hành tiêm tinh trùng vào bào tương noãn. Noãn thụ tinh bình thường có hình cầu, màng zona pellucida còn nguyên vẹn, có hai thể cực và hai tiền nhân, kích thước tiền nhân gần bằng nhau, nằm sát nhau ở vùng trung tâm của noãn. Tiền nhân có số lượng và kích thước của các thể hạt nhân tương đương nhau, sắp xếp thẳng hàng tại vùng giao nhau của màng hai tiền nhân. Những noãn có tiền nhân cách xa nhau, quá khác biệt nhau về kích thước hoặc có thể hạt nhân quá nhỏ được xem là bất thường. Noãn không thụ tinh thì bào tương thường trơn, có thể có màu nâu, đen hay thoái hóa và biến dạng.
Đánh giá chất lượng phôi [3]
Sau khi thụ tinh, hợp tử bắt đầu quá trình nguyên phân nhiều lần và tạo thành phôi. Quá trình này tương tự như quá trình nguyên phân ở tế bào sinh dưỡng. Khoảng 23 – 29 giờ sau khi ICSI, hợp tử bắt đầu phân chia lần thứ nhất tạo ra phôi hai tế bào. Đây chính là tín hiệu chứng tỏ sự phát triển của phôi. Việc đánh giá phôi ngày 3 dựa trên hình thái phôi theo các tiêu chuẩn như số lượng phôi bào, độ đồng đều của tế bào, tỷ lệ mảnh vỡ và tình trạng đa nhân của phôi bào.
Nồng độ β-hCG trong chẩn đoán thai
Sau khi được chuyển vào tử cung của người mẹ, phôi bắt đầu làm tổ và phát triển thành thai. Các thành phần trong tử cung người mẹ kết hợp với một số tế bào của thai sẽ hình thành nhau thai nhằm cung cấp chất dinh dưỡng cho thai từ máu mẹ. Hợp bào nuôi thai sẽ tiết ra hormone hCG (human Chorionic Gonadotropin) đi vào máu của mẹ để duy trì hoàng thể, cho phép tổng hợp progesterone, estrogen nhằm duy trì và hỗ trợ sự phát trển của lớp nội mạc tử cung. β-hCG là một tiểu đơn vị của hCG và là dấu hiệu để chẩn đoán thai sớm. Xét nghiệm nồng độ β-
hCG trong máu người phụ nữ đạt trên 5 mIU/mL thì người phụ nữ này được xem là đã mang thai.
Chẩn đoán thai lâm sàng
Vào tuần thứ 8 sau khi tiến hành ICSI, người mẹ sẽ được siêu âm để chẩn đoán thai lâm sàng. Siêu âm là phương pháp chẩn đoán bên ngoài thông qua hình ảnh không gây tổn thương, không đau đớn, thao tác đơn giản và có thể lặp lại nhiều lần. Hình ảnh siêu âm có thể quan sát chân thực độ lớn của tử cung, hình thái bào thai, vị trí và nhịp đập của tim thai. Đến cuối tuần thứ 6, tim bào thai bắt đầu đập nhịp nhàng, và tiếp đó, tay chân của thai nhi cũng dần dần hình thành. Như vậy, kết quả thai lâm sàng được xem là dương tính khi kết quả siêu âm có tim thai.
1.2.2. Hoạt hóa noãn nhân tạo
Mặc dù tỷ lệ thành công cao của ICSI, nhưng thất bại thụ tinh toàn bộ vẫn xảy ra trong 1 - 3% số chu kỳ ICSI sau khi tiêm tinh trùng [28]. Thất bại trong việc kích hoạt tế bào noãn được coi là nguyên nhân chính gây ra sự thất bại trong thụ tinh sau ICSI thông thường [32], [46]. Trong IVF, một nhóm bệnh nhân đặc biệt thường phải đối mặt với tình trạng thất bại thụ tinh sau ICSI như tinh trùng ít, yếu và dị dạng (OAT – oligoasthenoteratozoospermia) nặng và tinh trùng đầu tròn (globozoospermia: tinh trùng có đầu tròn, ít hoặc không có acrosome). Những dạng tinh trùng này thường chứa rất ít PLCζ so với những tinh trùng có hình dạng bình thường [22], [41], [48].
Đối với những trường hợp noãn không có hiện tượng thụ tinh sau khi tiêm tinh trùng do thất bại trong quá trình hoạt hóa noãn, người ta đã nghĩ đến cách khởi động quá trình này một cách nhân tạo. Nhiều phương pháp hoạt hóa noãn nhân tạo (AOA – artificial oocyte activation) khác nhau đã được áp dụng tại nhiều trung tâm IVF trên thế giới. Hai phương pháp AOA được biết đến nhiều nhất hiện nay là AOA bằng dòng điện và AOA hóa học. Với phương pháp AOA bằng dòng điện, một dòng điện rất nhỏ được sử dụng để kích thích noãn sau ICSI, điện trường sẽ tạo thành những lỗ nhỏ trên màng bào tương noãn và nhờ đó sẽ kích thích tạo
dòng Ca2+ bên trong noãn. Phương pháp này từng được áp dụng thành công trên noãn bò và noãn người [26]. Với phương pháp AOA bằng hóa học, những hợp chất hóa học (như calcium ionophore A213187, ionomycin, purimycin, strontium chloride,…) có thể được sử dụng để tạo ra sự gia tăng nồng độ Ca2+ và khởi động
phản ứng hoạt hóa noãn. Những thành phần này sẽ xúc tiến sự giải phóng Ca2+
nội bào từ các nguồn dự trữ của tế bào cho đến khi cạn, điều này sẽ tạo thuận lợi cho Ca2+ ngoại bào tràn vào. Nhờ đó mà nồng độ Ca2+ bên trong tế bào tăng lên, và kết quả là hoạt hóa noãn xảy ra.
1.3. Tổng quan kết quả nghiên cứu tại Việt Nam và thế giới
Hiện nay, ở một số trung tâm trên thế giới, AOA còn được mở rộng chỉ định đối với những trường hợp tinh trùng thu từ phẫu thuật (PESA – percutaneous epididymal sperm aspiration hay TESE – testicular sperm extraction). Cho đến nay, đa số các nghiên cứu về áp dụng AOA trong kỹ thuật ICSI là các báo cáo ca, loạt ca hoặc không đối chứng. Một vài nghiên cứu là ngẫu nhiên có đối chứng, trong đó cho thấy AOA có thể có hiệu quả cải thiện kết quả ICSI đối với các trường hợp tinh trùng bất thường [31], [55]. Tại Việt Nam, kỹ thuật ICSI được áp dụng thành công từ năm 1998 và đã trở thành kỹ thuật phổ biến tại tất cả các trung tâm IVF ở Việt Nam. AOA được thực hiện cho một số trường hợp tinh trùng bất thường hoàn toàn dạng đầu tròn hoặc bất động toàn bộ và đã cho kết quả điều trị khả quan. Năm 2011, nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Lan và cs. thực hiện tại Đơn vị hỗ trợ sinh sản An Sinh, bệnh viện An Sinh nghiên cứu trên 101 chu kỳ ICSI có bất thường tinh trùng nặng. Kết quả tỉ lệ thụ tinh ở nhóm thực hiện AOA cao hơn với nhóm đối chứng và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (80,8% so với 74,3%, p<0,05). Tuy nhiên, về tỉ lệ thoái hóa, tỉ lệ phôi khá và tốt lại không có sự khác biệt giữa hai nhóm [2]. Những số liệu trên cho thấy AOA có thể giúp tinh trùng vượt qua khiếm khuyết do bất thường nặng, cho phép noãn hoàn tất quá trình giảm phân, kết quả làm tăng tỉ lệ thụ tinh đáng kể.
Năm 2012, nhóm tác giả Ebner và cs. đánh giá kết quả ICSI sử dụng tinh trùng từ 29 bệnh nhân không tìm thấy tinh trùng trong mẫu (azoospermia) và 37 bệnh nhân ít tinh trùng (cryptozoospermia). Đây là nghiên cứu đa trung tâm thực hiện tại Úc và Đức. Kết quả cho thấy tỉ lệ thụ tinh ở nhóm ICSI-AOA bằng A23187 cao hơn so với nhóm ICSI không AOA và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (azoospermia 64,4% và cryptozoospermia 48,4% so với 34,7%, p<0,001). Kết quả lâm sàng 32 trẻ sinh sống trên 73 ca chuyển phôi [14]. Năm 2013, nhóm nghiên cứu Vanden Meerschaut thực hiện so sánh hiệu quả của AOA trên hai nhóm đối tượng thụ tinh kém và thất bại thụ tinh hoàn toàn. Nghiên cứu thực hiện ICSI tinh trùng của hai nhóm đối tượng trên noãn chuột, sau đó tiến hành sibling-AOA (AOA một nửa và không AOA một nửa). Kết quả, tỉ lệ thụ tinh nhóm thất bại thụ tinh hoàn toàn thực hiện AOA cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chỉ ICSI thường qui (74,2% so với 43,5%, p<0,001). Tuy nhiên, ở nhóm thụ tinh kém, kết quả giữa hai nhóm ICSI-AOA và ICSI không có sự khác biệt đáng kể [54]. Một thống kê của nhóm Murugesu và cs. (2017) tiến hành so sánh các nghiên cứu thực hiện IVF có kết hợp thực hiện AOA, số liệu cho thấy sử dụng AOA kết hợp với ICSI có tỉ lệ thụ tinh, tỉ lệ làm tổ, tỉ lệ có thai lâm sàng và tỉ lệ trẻ sinh sống cao hơn nhóm không AOA [29].
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, phạm vi nghiên cứu
Đối tượng người vợ và người chồng được lựa chọn đồng thời, mẫu đối chứng là những trường hợp vợ bình thường, tinh trùng chồng yếu, đã thực hiện IVF/ICSI không sử dụng phương pháp kích hoạt noãn từ năm 2017 đến năm 2019.
Mẫu đánh giá được lựa chọn từ những trường hợp tương tự, đã thực hiện IVF/ICSI có sử dụng phương pháp hoạt hóa noãn bằng chất hóa học từ tháng 8 năm 2019 đến tháng 8 năm 2020.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu này được thực hiện và thu thập số liệu tại khoa Hỗ trợ sinh sản, Bệnh viện A Thái Nguyên. Dự kiến nghiên cứu trong 1 năm từ tháng 8 năm 2019 đến tháng 8 năm 2020.
2.3. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
2.3.1. Trang thiết bị
- Tủ thao tác vô trùng 2 người - Tủ cấy CO2 nuôi phôi
2.3.2. Dụng cụ
- Đĩa petri Φ35mm
- Đĩa petri Φ100mm
- Đồng hồ bấm giờ
- Micropipette có độ điều chỉnh từ 10µl - 100µl
- Đầu côn 10 µl, đầu côn 200 µl
- Falcon 10ml
2.3.3. Hóa chất nghiên cứu
- Chất hóa học: Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus 1mg
(10634-1MG, Sigma-Aldrich – Mỹ)
- Môi trường nuôi cấy noãn G-TL
- Dầu phủ OVOIL
2.4. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ thụ tinh sau ICSI.
Nội dung 2: Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến chất lượng phôi hữu dụng ngày 3.
Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn tỉ lệ lên phôi ngày 5 và chất lượng phôi ngày 5.
Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ có thai.
2.5. Phương pháp
2.5.1. Phương pháp kích hoạt noãn
Noãn sau khi ICSI được ủ trong môi trường đã pha hóa chất ionomycin 2 lần, mỗi lần 10 phút, thời gian nghỉ giữa 2 lần là 20 phút. Sau đó noãn đã hoạt hóa được nuôi trong đĩa nuôi cấy phôi
2.5.2. Các phương pháp đánh giá nhận mẫu
Công thức tính cỡ mẫu: N= 2𝐶
(𝐸𝑆)2
Phương pháp đánh giá lựa chọn mẫu, loại trừ mẫu đối tượng người vợ và người chồng:
Đối tượng người vợ: Bệnh nhân dưới 38 tuổi, dự trữ buồng trứng bình thường (số lượng nang thứ cấp ≥ 6), các chỉ số nội tiết (Estradiol, Luteninizing Hormone, Follicular Stimulating Hormone, Prolactin, Progesteron) trong ngưỡng bình thường. Buồng tử cung bình thường.
Đối tượng người chồng: Đối tượng nghiên cứu được chọn lọc dựa tên kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn WHO 2010 [57]. Tinh trùng OAT nặng, <1 triệu tinh trùng bình thường/mẫu (theo tiêu chuẩn WHO 2010), bất thường hình dạng đầu trên 80%, mẫu tinh trùng phẫu thuật, thủ thuật.
Bảng 2.1. Đánh giá tinh dịch theo tiêu chuẩn WHO 2010
Các tham số xét nghiệm Trị số bình thường (Tiêu chuẩn Who 2010)
Kết quả xét nghiệm
Màu sắc Trắng sữa
Thời gian ly giải 15-60 phút
Thể tích tinh dịch ≥ 1,5 ml
pH ≥ 7,2
Mật độ ≥ 15.106 TT/ml
Tổng số tinh trùng > 39.106 TT
Di động tiến tới (PR) Di động không tiến tới (NP)
Bất động (IM)
PR ≥ 32 %
Hoặc PR + NP ≥ 40 %
Tỷ lệ tinh trùng sống ≥ 58 %
Đánh giá khả năng thụ tinh
Sự thụ tinh được đánh giá khoảng 16 giờ sau ICSI. Sự thụ tinh bình thường được xác nhận bởi sự hiện diện của 2 nhân (PN) và sự xuất hiện của thể cực thứ hai. Sau khi dấu hiệu thụ tinh của các tế bào noãn được quan sát, noãn đã thụ tinh được nuôi cấy trong một giọt môi trường 25µL được phủ bằng dầu ở 37℃ trước khi chuyển phôi. Phôi được theo dõi từ ngày thứ 0 đến ngày thứ 5.
Đánh giá chất lượng phôi ngày 3, ngày 5 dựa trên chuẩn đồng thuận của ALPHA 2011 [3].
Hiện nay đánh giá chất lượng phôi chủ yếu là đánh giá của chuyên viên phôi học được đào tạo dựa theo chuẩn đồng thuận của ALPHA 2011. Chuyên viên có thể đánh giá chủ quan bằng mắt khi quan sát hình ảnh phôi trên kính hiển vi hoặc dựa vào hệ thống Timelapse quan sát động học của phôi xuyên suốt từ quá trình thụ tinh đến giai đoạn ngày 3, ngày 5 để đưa ra kết luận về chất lượng phôi.
Tại trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện A Thái Nguyên, đánh giá chất lượng phôi được đánh giá bằng cách quan sát trực tiếp hình ảnh phôi trên kính hiển vi.
Phôi được đánh giá và xếp loại thành 4 bậc: rất tốt (loại 1), tốt (loại 2), trung bình (loại 3), xấu (loại 4). Phôi hữu dụng là phôi loại 1, 2, 3.
Để đánh giá chính xác chất lượng phôi phát triển qua từng giai đoạn, phải chú ý những cột mốc thời gian sau:
- Phôi phân chia sớm (2 tế bào) : 26h±1
- Phôi phân chia ngày 2 (4 tế bào): 44h±1
- Phôi phân chia ngày 3 (8 tế bào) 68h±1
- Phôi dâu ( morula) ngày 4: 92h±1
Bảng 2.2: Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi ngày 3 dựa theo chuẩn đồng thuận của ALPHA 2011
Phân loại Số phôi bào Kích thước phôi bào Tỉ lệ phân mảnh Loại I Rất tốt 8 Đều Khác biệt ít (<25%) Đang nén 0-10%
7 Không đều, khác biệt nhiều (1 lớn, 6
nhỏ) Hoặc/và compacting 0-10%
Loại 2
Tốt
7
Đều
Không đều, khác biệt ít (<25%) 0-20%
8
Đều
Không đều (khác biệt ít) 15-20%
≥9 Đều
Không đều (khác biệt ít) 0-10%
6 Đều hoặc không đều 0-15%
Bất kỳ Đang nén, đã nén
Loại 3
Trung bình
5 Đều hoặc không đều
≤15%
Bất kỳ Khác biệt nhiều
Bất kỳ Đa nhân trong 1 phôi bào
Bất kỳ Xuất hiện không bào
Loại 4
Xấu
Bảng 2.3: Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng phôi ngày 5 dựa theo chuẩn đồng thuận ALPHA 2011
Độ giãn nở Giai đoạn phát triển của phôi blastocyst và trạng thái
1 Khoang phôi chiếm ít hơn ½ thể tích phôi
2 Khoang phôi chiếm nhiều hơn ½ thể tích phôi
3 Khoang phôi chiếm gần như đầy thể tích phôi
4
Khoang phôi giãn nở hơn so với thể tích phôi lúc đầu đồng thời làm mỏng màng ngoài
5 Đang thát màng
6 Đã thoát màng
ICM Chất lượng của ICM
A Rất nhiều tế bào, liên kết chặt chẽ
B Nhiều tế bào, gắn kết rời rạc
C Rất ít tế bào
D Rất ít tế bào, liên kết rời rạc
TE Chất lượng của TE
A Nhiều tế bào, hình thành một lớp kết dính