Khoảng 24-26 giờ sau khi diễn ra sự thụ tinh giữa noãn và tinh trùng, hợp tử bắt đầu phân chia đầu tiên đối xứng qua trục. Trung thể của tinh trùng kiểm soát sự phân chia đầu tiên sau thụ tinh [12]. Trong chu kỳ phân bào đầu tiên ở giai đoạn cuối, bào tương của hợp tử kéo dài ra và thắt lại dần ở giữa cho đến khi hợp tử phân chia thành hai phôi bào, quá trình này tiếp tục trong những chu kỳ phân bào tiếp theo. Trong 3 chu kỳ phân bào đầu tiên, kích thước của phôi thường ít thay đổi. Phôi có 2 đến 8 phôi bào phụ thuộc chủ yếu vào sự dịch mã (translation) từ các chất liệu RNA của mẹ để phân chia [33].
Những bất thường hình thái trong quá trình phát triển phôi làm giảm khả năng làm tổ [18], [56].
Mảnh vụn tế bào: Mảnh vụn được tạo ra do các phôi bào luôn thay đổi hình dạng, các phôi bào tiếp xúc hoặc không tiếp xúc với nhau trong quá trình phân chia, vì vậy tạo nên những mảnh vụn tế bào sau phân chia.
Phôi bào đa nhân: Phôi bào đa nhân có thể xuất hiện ở bất kỳ chu kỳ phân chia nào từ 2 phôi bào đến giai đoạn phôi nang, nhưng quan sát rõ ở giai đoạn phôi phân chia.
Kích thước phôi bào không đều: Một trong những nguyên nhân làm kích thước phôi bào không đều là do sự phân chia không đồng bộ và thiếu cân đối hoặc 1 hay nhiều phôi bào ngừng phân chia.
Tốc độ phân chia phôi: Tốc độ phân chia có liên quan đến khả năng sống của phôi. Phôi phân chia chậm thường có khả năng làm tổ kém hơn. Phôi khỏe mạnh có tốc độ phân chia vào khoảng 18-20 giờ (2 phôi bào sau 24 giờ thụ tinh, 4 phôi bào sau dưới 48 giờ và 8 phôi bào hoặc hơn trước 72 giờ). Phôi phân chia chậm thường có khả năng làm tổ và sinh sống thấp hơn phôi phát triển bình thường. Vì vậy khi đánh giá lựa chọn phôi, chuyển viên phôi thường kết hợp các yếu tố: tốc độ phát triển phôi, hình thái của phôi như số lượng mảnh vụn, độ phát triển của phôi bào, và số lượng nhân tế bào.
3.3. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ lên phôi ngày 5 và chất lượng phôi ngày 5
3.3.1. Tỉ lệ lên phôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng
Phôi nuôi ngày 5 hiện nay tại trung tâm Hỗ trợ sinh sản Bệnh viện A chủ yếu là phôi nuôi thụ động, nghĩa là các phôi tốt được ưu tiên lưu giữ lại giai đoạn ngày 3. Các phôi chất lượng kém hoặc trường hợp bệnh nhân có nhiều phôi sẽ được tư vấn theo dõi phôi đến giai đoạn ngày 5.
Đồ thị 3.1: Chất lượng phôi nuôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng Do nuôi phôi dài ngày cho nguy cơ mất phôi rất cao, các yếu tố ảnh hưởng đến phôi giai đoạn ngày 5 bao gồm rất nhiều yếu tố như môi trường nuôi cấy, tủ cấy, chất lượng phôi, chất lượng khí nuôi cấy,...trong điều kiện in vitro, người ta ghi nhận có khoảng 50% - 70% phôi người khi nuôi cấy không thể phát triển đến giai đoạn phôi nang [20], [21]. Do vậy, có sự không tương đồng giữa chất lượng phôi trong hai nhóm nghiên cứu và đối chứng. Tuy nhiên nhìn chung có thể thấy chất lượng phôi loại 1 chiến rất ít (5% và 10%) trên tổng số phôi nuôi, và phôi chất lượng xấu (loại 4) chiếm cao nhất (36% và 45%).
5% 10% 35% 26% 22% 19% 36% 45% N G H I Ê N C Ứ U Đ Ố I C H Ứ N G
Bảng 3.4: So sánh tỉ lệ lên phôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng
Đối tượng Tổng số phôi lên
ngày 5 Tỉ lệ
ICSI/AOA 113 39%
ICSI (Đối chứng) 741 33%
P-value 0,212
Độ tin cậy 95%
Từ kết quả nghiên cứu trong bảng 3.4 có thể thấy tỉ lệ lên phôi ngày 5 của phôi trong nhóm nghiên cứu có sử dụng kỹ thuật AOA cho tỉ lệ lên phôi cao hơn (39%) so với nhóm đối chứng không sử dụng kỹ thuật AOA (33%) với P > 0,05. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên trong tỉ lệ phôi nuôi từ 3 ngày có thể thấy tỉ lệ phôi tốt của 2 nhóm là như nhau, phôi xấu (loại 4) của nhóm đối chứng lại cao hơn. Trong đó, một yếu tố hết sức quan trọng của phôi ngày 5 là chất lượng phôi nuôi từ ngày 3. Những phôi ngày 3 chất lượng tốt được đánh giá bằng hình ảnh phôi cũng có sự tương đồng nhất định với sự bất thường bộ gene của phôi [51].
Ở người phôi dâu bắt đầu hình thành khi phôi ở giai đoạn 8 phôi bào và có tính toàn năng (toptipotent), bằng chứng là khi tiến hành chẩn đoán trước làm tổ, nếu sinh thiết một hoặc hai phôi bào thì phôi vẫn có khả năng phát triển tiếp và bắt đầu quá trình nén (compaction). Quá trình phôi nén hình thành các liên kết chặt chẽ giữa các phôi bào, phần phôi bào tiếp xúc với nhau tăng lên và tạo thành một khối. Khi phôi bắt đầu kết đặc lại, các phôi bào tương tác với nhau làm các phôi bào không còn tính toàn năng (totipotency) và đây là sự khởi đầu cho sự sao mã DNA của phôi.
Trong quá trình hình thành phôi nang, 2 loại phôi bào được hình thành là tế bào phôi ICM (inner cell mass) và tế bào lá nuôi TE (trophectoderm). Tế bào lá nuôi là loại tế bào được biệt hóa đầu tiên trong quá trình hình thành thai. Hai loại tế bào này ngày càng khác nhau khi chúng di chuyển tới các vị trị mới trong quá trình tạo nang. Tế bào lá nuôi có hình bầu dục và phân cực (polarization) trong khi đó tế bào phôi vẫn giữ hình tròn và hình thái không thay đổi. Các tế bào lá nuôi nối với nhau qua những phần tiếp xúc bề mặt nhỏ, trong khi đó tế bào phôi tiếp xúc chặt chẽ với nhau tạo thành một khối. Vị trí và sự phát triển của tế bào lá nuôi và tế bào phôi phụ thuộc vào sự phân cực và sự hình thành trục phân bào của phôi được hình thành từ khi noãn mới bắt đầu được thụ tinh. Các tế bào phôi di chuyển về phía một cực của phôi gọi là cực phôi (embryonic pole), các phôi bào này liên kết chặt với nhau và có đặc tính đa năng (pluripotent). Các tế bào lá nuôi tạo thành hàng rào bên ngoài bảo vệ mầm phôi và được biệt hóa để thực hiện chức năng này [40]. Để đảm bảo phôi phát triển và làm tổ, số lượng phôi bào của phôi nang và tỷ lệ giữa số lượng tế bào phôi và số lượng tế bào lá nuôi được chi phối và điều hòa bởi hệ thống gen. Sau giai đoạn nén, vào cuối ngày thứ tư sau khi thụ tinh, phôi bắt đầu nở rộng và tạo nang dịch bên trong. Các phôi bào bắt đầu biệt hóa và phát triển thành hai dòng thế bào với hình dạng và chức năng khác nhau. Cụ thể, các tế bào ở lớp ngoài cùng của phôi bắt đầu liên kết với nhau và tạo thành một lớp tế bào biểu mô dày. Lớp tế bào bên ngoài này được gọi là lớp tế bào lá nuôi (Trophectoderm - TE), đồng thời 2 đến 4 lớp tế bào ở lớp trong cùng của phôi phân chia và phát triển thành khối tế bào nội mô (Inner cell mass - ICM) (hình 3.3). Quá trình tạo nang bao gồm sự tích lũy dịch vận chuyển bởi các tế bào lá nuôi.
Hình 3.2. Hình ảnh phôi nang
Sự hình thành và phát triển phôi nang phụ thuộc vào một số yếu tố: chất lượng tinh trùng, tuổi của mẹ cũng như các yếu tố khác liên quan đến sự phát triển của phôi ở giai đoạn trước đó như: Số lượng noãn thu được, số lượng noãn thụ tinh, số lượng hợp tử, và số lượng phôi phát triển đến giai đoạn 8 phôi bào vào ngày 3 cũng ảnh hưởng đến sự hình thành phôi nang. Phôi nang thường hình thành khoảng 100 giờ sau khi thụ tinh tương đương 5-6 ngày nuôi cấy. Sự phát triển còn tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy và thành phần của môi trường nuôi cấy.
Mặc dù còn nhiều tranh cãi về tỉ lệ thành công của chuyển phôi ngày 3 hay ngày 5, và các nghiên cứu cũng chưa có sự thống nhất về một kết quả cụ thể [17], [37]. Nhưng hiện nay, các bác sĩ lâm sàng thường ưu tiên chuyển phôi ngày 5 hơn là phôi ngày 3 trong trường hợp bệnh nhân có đồng thời phôi ngày 3 và ngày 5 trữ đông. Giai đoạn ngày 5 là giai đoạn phôi nang đã đạt đến cấp độ phân hóa cấu trúc cao hơn cần cho sự làm tổ. Bên cạnh đó, chuyển phôi nang vào buồng tử cung còn được xem là phù hợp với cửa sổ làm tổ. Vì vậy, tỉ lệ phôi nang cao hơn ở nhóm nghiên cứu vẫn cho những kết quả khả quan trong quá trình điều trị vô sinh hiếm muộn của các cặp vợ chồng.
3.3.2. Chất lượng phôi ngày 5 giữa 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng
Tương tự như phôi ngày 3, phôi hữu dụng ở giai đoạn ngày 5 bao gồm loại 1, loại 2, loại 3. Những phôi nang chất lượng tốt sẽ có khả năng làm tổ cao hơn những phôi có chất lượng kém [5]. Vì vậy, chất lượng phôi tốt sẽ là dấu hiệu khả
quan cho các kết quả tiếp theo của chu kỳ IVF như tỉ lệ có thai, tỉ lệ sinh sớm, tỉ lệ trẻ bị dị tật bẩm sinh,..
Bảng 3.5. So sánh chất lượng phôi ngày 3 giữa nhóm bệnh nhân sử dụng phương pháp AOA và đối chứng
Từ kết quả ở bảng 3.5 có thể thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa chất lượng của 2 nhóm bệnh nhân. Chất lượng phôi loại 1 (rất tốt) ở nhóm nghiêm cứu sử dụng AOA cho tỉ lệ thấp hơn (5%) so với nhóm đối chứng (23%) với P<0,05 có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên ở chất lượng phôi loại 2 (tốt) thì phôi ở nhóm đối chứng cho tỉ lệ cao hơn (24%) so với nhóm đối chứng (21%). Kết quả này cũng tương tự ở nhóm phôi loại 3 (trung bình) khi nhóm nghiên cứu có tỉ lệ cao hơn. Tổng quát từ chất lượng phôi loại 1, loại 2, loại 3 có thể thấy nhóm đối chứng cho tỉ lệ chất lượng phôi đồng đều giữa cả 3 loại, tỉ lệ phôi xấu (loại 4) chiếm 36% cao hơn tỉ lệ phôi xấu ở nhóm nghiên cứu (25%). Có thể thấy mặc dù cho tỉ lệ phôi xấu nhiều nhưng nhóm đối chứng lại cho tỉ lệ phôi hữu dụng (loại 1) rất cao, ngược lại, nhóm nghiêm cứu tuy cho tỉ lệ phôi hữu dụng (loại 1, 2, 3) cao nhưng lại không đồng đều và tỉ lệ phôi loại 1 (rất tốt) không nhiều. Do chênh lệch số
Đối tượng Tổng phôi lên ngày 5
Chất lượng phôi ngày 5
Rất tốt Tốt TB Số phôi Tỉ lệ (%) Số phôi Tỉ lệ (%) Số phôi Tỉ lệ (%) ICSI/AOA 5% 24% 46% ICSI (Đối chứng) 65/287 23% 21% 20% P-value <0,05 <0,05 <0,05 Độ tin cậy 95%
lượng phôi nuôi từ ngày 3 lên ngày 5 nên chưa thể kết luận chính xác chất lượng phôi ở nhóm nào cho tỉ lệ tốt hơn. Cần tiếp tục nghiên cứu thêm để có kết luận chính xác.
3.4. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp hoạt hóa noãn đến tỉ lệ có thai
Bảng 3.6. So sánh giữa 2 nhóm AOA và đối chứng
Đối tượng Tổng số ca có thai Tỉ lệ
ICSI/AOA 16/30 53%
ICSI (Đối chứng) 92/176 52%
P-value 0,915
Độ tin cậy 95%
Kết quả từ bảng 3.5 cho thấy tỉ lệ có thai của 2 nhóm nghiên cứu và đối chứng có sự khác biệt (53% và 52%); với P >0,05 sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Trong nghiên cứu của Ebner và cs 2012 cũng cho kết quả phôi ở nhóm nghiên cứu có tỉ lệ thai lâm sàng cao hơn có ý nghĩa thống kê [14].
Do thời gian thực hiện nghiên cứu đánh giá có hạn, chưa thể theo dõi đánh giá đến giai đoạn ảnh hưởng của hoạt hóa noãn bằng chất hóa học đến sức khỏe của trẻ sơ sinh. Hiện nay cũng đã có 1 vài nghiên cứu về mức ảnh hưởng của AOA đến dị tật bẩm sau sau chuyển phôi tuy nhiên chưa có khẳng định nào cho thấy sử dụng AOA hóa học gây nguy hiểm cho sức khỏe của trẻ sơ sinh [7]. Theo Miller N. và cs. theo dõi và đánh giá tình trạng của 793 thai phụ năm 2016, trong đó có 595 trường hợp ICSI thường qui và 83 trường hợp ICSI thực hiện AOA. Số liệu cho thấy kết quả chu sinh như tuổi thai và cân nặng trẻ, đồng thời yếu tố thai kỳ của mẹ ở những trường hợp thực hiện AOA sau ICSI không có sự khác biệt so với các chu kỳ ICSI thường quy, ở hai nhóm sinh 1 trẻ và sinh đôi. Sau sinh,
không ghi nhận các bất thường nặng (tim, sinh dục và phát triển chân tay) ở nhóm trẻ ICSI-AOA [27].
Tế bào noãn của chuột thường được sử dụng để nghiên cứu sự hoạt hóa tế bào noãn ở người [53]. Tuy nhiên, có thể việc sử dụng Ca+2 để kích hoạt noãn trong quá trình thụ tinh chỉ có thể gây ra một mức tăng Ca+2 lớn duy nhất , trái ngược với sự dao động nhiều Ca+2 trong quá trình thụ tinh sinh lý. Trong một nghiên cứu gần đây trên mô hình chuột wobbler, tất cả các tác nhân kích hoạt đều có hiệu quả, nhưng việc sử dụng Stronti clorua kết hợp với xung điện có hiệu quả hơn so với ionomycin về tỷ lệ thụ tinh và phát triển phôi [53]. Nghiên cứu tương tự cũng kết luận rằng tất cả các yếu tố kích hoạt không gây ra bất kỳ dị tật nào sau khi cấy ghép cho con cái, cho thấy rằng AOA có thể được áp dụng mà không gây nguy hiểm cho sức khỏe của trẻ sơ sinh. Điều này đã được chứng minh gần đây thông qua việc AOA không có rối loạn dấu ấn (imprinting disorders) ở trẻ sinh sống [10]. Tuy nhiên, không nên loại trừ khả năng rối loạn dấu ấn trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), vì AOA được thực hiện thông qua IVF [4].
Tỉ lệ có thai được cho là một trong những kết quả quan trọng nhất trong thụ tinh ống nghiệm. Các yếu tố ảnh hưởng đến tỉ lệ có thai bao gồm chuyển phôi tươi hay phôi đông lạnh, tuổi phôi, chất lượng phôi, niêm mạc, buồng tử cung, nội tiết tố của người nhận phôi chuyển. Trong đó chất lượng phôi là một trong những yếu tố rất quan trọng đóng góp vào sự thành công của một chu kỳ IVF.
So sánh đánh giá tỉ lệ có thai giữa hai nhóm nghiên cứu và đối chứng là một trong những mục đích để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của kỹ thuật kích hoạt noãn bằng chất hóa học.
KẾT LUẬN
Phương pháp kích hoạt noãn bằng hóa học giúp tăng tỉ lệ thụ tinh của IVF/ISCI đối với các trường hợp bất thường tinh trùng nặng.
Nhóm 1 (ICSI + AOA) có 284 noãn từ 30 chu kỳ điều trị ICSI do bất thường tinh trùng nặng từ tháng 8 /2019 đến tháng 8/2020, nhóm 2 (ICSI) có 1445 noãn từ 176 chu kỳ đã điều trị tại Bệnh viện A Thái Nguyên. Có sự gia tăng đáng kể về tỉ lệ thụ tinh ở nhóm 1 so với nhóm 2 (93% so với 89%, P<0,05), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục theo dõi đánh giá trên cỡ mẫu lớn và làm các xét nghiệm gene đối với noãn IVF/ICSI được kích hoạt noãn bằng hóa học để hỗ trợ thụ tinh.
Đồng thời cần đánh giá trên đối tượng trẻ sinh sống từ noãn nghiên cứu để có thêm khẳng định về tính an toàn và hiệu quả của phương pháp này.
Xây dựng quy trình AOA chuẩn để áp dụng thường quy trong các trường hợp bất thường tinh trùng nặng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Hồ Mạnh Tường, Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc Lan (2011), Thụ
tinh trong ống nghiệm, NXB Giáo Dục Việt Nam, tr. 44-45.
[2]. Nguyễn Thị Thu Lan, Mai Công Minh Tâm, Trương Thị Thanh Bình,
Huỳnh Gia Bảo, Hà Thanh Quế, Phạm Thanh Xuân, Hồ Mạnh Tường (2011). “Hoạt hóa noãn bằng calcium ionophore sau tiêm tinh trùng vào bào tương noãn.”,
Thời sự y học, 66, tr. 3-6.
Tài liệu Tiếng Anh
[3]. Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology (2011), “The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: preceedings of an expert meeting”, Hum Reprod, 26(6), pp. 1270-
1283.