3.3.1. CÔ LẬP:
Các mẫu cao chiết thu được từ cây hương nhu tía là những hỗn hợp phức tạp của nhiều hợp chất hữu cơ. Việc tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp được thực hiện trên cột silicagel với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại một vài lần để thu được chúng ở dạng tinh sạch, đáp ứng yêu cầu xác định cấu trúc hóa học.
Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành phân lập hoạt chất từ mẫu cao bằng phương pháp sắc ký cột cao áp và trung áp.
Nhận thấy cao EtOAc có hoạt tính và cho nhiều vết rõ ràng trên bản mỏng. Do đó, chúng tôi lựa chọn cao EtOAC để cô lập các hợp chất.
Hình 3.2: Sắc kí lớp mỏng cao EtOAc hương nhu tía.
Tiến hành cô lập bằng phương pháp sắc ký cột hấp thu với máy sắc ký cột HPLC.
• Kích thước cột 40 x 300mm.
• Silicagel 0.04 x 0.06 mm.
• Dung môi ổn định cột là n-hexan
Dùng bơm để bơm dung môi n-hexan ổn định cột. Sau khi ổn định cột, nạp mẫu cao EtOAc (10g) dạng khô vào cột. Tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly. Lấy thể tích mỗi phân đoạn 250mL. Theo dõi cột bằng sắc ký lớp mỏng, hiện vết bằng cách phun dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH và hơ nóng trên bếp điện.
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc. Bảng 3.1: Kết quả sắc ký cột HPLC điều chế cao EtOAc Phân
đoạn
Hệ dung môi Kết quả thử TLC
A HE 75:25 Một vết chính màu tím hồng Cao EtOAc 10 g Phân đoạn B Phân đoạn C Phân đoạn D Phân đoạn E Phân đoạn F Phân đoạn G Phân đoạn H Phân đoạn A Phân đoạn I
B HE 75:25 Một vết chính màu vàng C HE 50:50 Một vết chính màu vàng D HE 50:50 Nhiều vết E HE 25:75 Nhiều vết F HE 25:75 Một vết chính màu vàng nâu G HE 25:75 Nhiều vết
H EtOAc Vệt kéo dài I EtOAc Vệt kéo dài
3.3.2. TINH CHẾ: 3.3.2.1. Os01:
Ở phân đoạn C xuất hiện kết tinh màu vàng. Rửa nhiều lần bằng n-Hexan. Kết tinh lại nhiều lần trong MeOH. Thu được 22 mg chất kết tinh hình kim màu vàng. Ký hiệu: Os01.
(a) (b)
Hình 3.3: Tinh chế Os01: (a): Trước, (b): Sau 3.3.2.2.Os02:
Ở phân đoạn F (m=196.4mg) thấy có một vết chính màu vàng nâu, tiến hành sắc ký cột gradient bắt đầu từ hệ dung môi CHCl3 100% đến hệ dung môi CHCl3: MeOH 92:8. Thu được 13 mg chất dạng bột vô định hình màu trắng. Ký hiệu là Os02.
3.3.2.3. Os03:Ở phân đoạn A xuất hiện khối bột vô định hình màu trắng. Tiến hành rửa nhiều lần bằng MeOH. Nhận thấy khối bột màu trắng tan một phần trong MeOH. Kết tinh lại nhiều lần thu 25mg được chất bột vô định hình màu trắng. Ký hiệu: Os03.
(a) (b)
Hình 3.4: Tinh chế Os03: (a) Trước, (b) sau. 3.3.2.4. Os04:
Ở phân đoạn B (m= 274mg) thấy có một vết chính màu vàng, tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi sử dụng giải ly là CHCl3 – MeOH 95:5. Thu được 5 phân đoạn. Ở phân đoạn EB1 thu được một hỗn hợp chất dạng bột màu vàng nhạt (53mg).
Tiếp tục tiến hành sắc ký cột hỗn hợp trên với hệ dung môi 97:3. Thu được 14mg chất kết tinh hình kim màu vàng nhạt. Ký hiệu là Os04.
3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC:
Nhận danh cấu trúc của chất đã phân lập được thông qua phổ 1H-NMR, 13C- NMR, HSQC, HMBC.
3.5. THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TIỂU ĐƯỜNG CỦA CAO VÀ CÁC
CHẤTPHÂN LẬP ĐƯỢC:
3.5.1.PHA HÓA CHẤT: -Dung dịch chất ức chế: -Dung dịch chất ức chế:
•Cân 1mg chất sạch (đã khô dung môi) pha trong 2.5ml dung môi DMSO, tương ứng với nồng độ 100 µg/ml (khi pha vào tổng thể tích 100 µl của mẫu thử hoạt tính)
•Hút lần lượt 800; 600; 400; 200; 0 µl dung dịch nồng độ 100 µg/ml pha với các thể tích DMSO tương ứng: 200; 400; 600; 800; 1000 µl. Ta có một dãy các nồng độ giảm dần của chất ức chế: 100; 80; 60; 40; 20; 0 µg/ml.
- Dung dịch đệm Phosphate pH = 6.8:
•Cân 7.2 mg Na2HPO4 và 2.8625 mg KH2PO4 pha trong 250 ml nước khử ion.
- Dung dịch PNP chuẩn nồng độ 100 µmol/l:
•Cân 1.4 mg PNP khan định mức trong 10 ml nước khử ion.
•Hút 1ml dung dịch trên định mức lại bằng nước khử ion thành 10 ml. - Dung dịch PNP-Glc:
•Cân 21.625 mg PNP-Glc khan định mức bằng nước khử ion thành 25 ml dung dịch.
- Enzym 0.03U/ ml: - Mẫu đối chứng:
•Nghiền nát một viên thuốc Glucobay( 50mg Acarbose) hòa tan trong dung dịch nước, khuấy đều, để lắng, lọc nhiều lần bằng phễu hút chân không. Định mức dung dịch trên thành 125 ml.
Hình 3.5: Mẫu chất ức chế ở các nồng độ. Hình 3.6: Mẫu thử hoạt tính.
3.5.2. TIẾN HÀNH: Dựng đường chuẩn: Dựng đường chuẩn:
Cân PNP pha trong đệm pH = 6.8 có nồng độ 100 µM, sau đó pha loãng lần lượt thành các dung dịch có nồng độ 80, 60, 40, 20, 0 µM. Thể tích (µL) 0 20 40 60 80 100 V dd 100µM 0 20 40 60 80 100 V dd pH 6.8 100 80 60 40 20 0 Thử hoạt tính:
Thử hoạt tính ức chế men α-glucosidase của các mẫu chất/cao và so sánh với Acarbose để so sánh:
Lần lượt cho vào plate thí nghiệm các hóa chất theo bảng sau:
Bảng 3.2 : Cách pha mẫu thử hoạt tính:
Tác chất Thể tích (µl)
Mẫu Blank Mẫu đối chứng Mẫu ức chế Ci
Dung dịch chất ức chế 25 25 25 Đệm phosphate pH=6.8 25 25 25 Enzyme 0 25 25 Nước khử ion 25 0 0 Ủ ở nhiệt độ 37oC trong 30 phút Chất nền PNP-Glc 25 25 25 Ủ ở nhiệt độ 37o C trong 20 phút Đo độ hấp thu quang
Đo độ hấp thu quang A λ = 405nm các mẫu thử. Dựa vào đường chuẩn để xác định lượng glucose sinh ra, từ đó xác định phần trăm ức chế và suy ra chỉ số IC50.
Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.
4.1. KẾT QUẢ CHIẾT XUẤT CAO:
4.1.1. CHIẾT XUẤT CAO EtOH:
Từ 5kg nguyên liệu tươi thu được146g cao etanol thô.
Đem cao EtOH thô lắc lần lượt với các dung môi: n-hexan, EtOAc thu được các loại cao như sau:
Bảng 4.1. Khối lượng các loại cao so với nguyên liệu
Cao Khối lượng Độ ẩm (%) % Nguyên liệu Tổng 146 21,2 2.3
n-Hexan 27 16.3 0.452 EtOAc 12.3 11.6 0.206 MeOH 94 35.4 1.214
Từ bảng số liệu trên, nhận thấy thành phần của hương nhu tía chứa nhiều hợp chất có độ phân cực mạnh do lượng cao MeOH chiếm tỷ lệ cao nhất.
4.2. KẾT QUẢ CÔ LẬP VÀ TINH CHẾ
Từ 10g cao EtOAc tiến hành sắc ký cột tách ra thành 9 phân đoạn. Cô lập được 4 hợp chất.
4.2.1. Os01:
4.2.1.1. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA Os01:
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH: Giải ly bằng hệ CHCl3 – MeOH 9:1 cho vết màu vàng có Rf = 0.25. 85:15 cho vết màu vàng có Rf = 0.37. Hình 4.1 : Hợp chất Os01 Hình 4.2 : Sắc kí lớp mỏng Os01
(hệ dung môi CHCl3-Me 85 :15)
4.2.1.2. NHẬN DANH CẤU TRÚC Os01:
Phổ 13
C-NMR (phụ lục 2) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 3) cho thấy tín hiệu của 15 carbon: 9 carbon tứ cấp và 6 carbon olefin. Trong đó:
•Một nhóm carbonyl >C=O ở độ chuyển dịch 181.6 ppm.
•Sáu nhóm cacbon tứ cấp nối với oxy(=C–O) ở các độ chuyển dịch (163.9; 161.5; 164.1; 157.3; 145.7; 149.7)ppm.
•Hai nhóm cacbon tứ cấp kề nối đôi >C= ở độ chuyển dịch 103.7ppm và 121.5 ppm.
•Sáu nhóm cacbon metin kề nối đôi –CH= ở các độ chuyển dịch (102.8; 98.8; 93.8; 113.3; 116.0; 118.9) ppm.
Phổ 1H-NMR (phụ lục 1)cho tín hiệu của tổng cộng 7 proton. Trong đó:
•Tín hiệu tại độ chuyển dịch 12.938 ppm là tín hiệu của liên kết hydro nội phân tử. (-OH-5)
•Có 2 mũi đôi của proton nhân thơm tại 6.16 ppm (1H, d, J=2Hz, H–6) và ở 6.41 ppm (1H, d, J=1.5, H–8) tương tác meta trên vòng thơm. Suy ra Os01 có một vòng benzen thế ở 4 vị trí.
•Một mũi đơn của proton nhân thơm tại độ chuyển dịch 6.63 ppm (1H, s,H-3) chứng tỏ proton này không có tương tác với các proton khác..
•Hai proton nhân thơm H–2’ và H–6’ cho tín hiệu bị xen phủ ở vùng trường thấp 7.38 ppm.
•Một mũi đôi của proton nhân thơm tại độ chuyển dịch 6.86 ppm (1H, d, J=8.5, H–5’) chứng tỏ nó tương tác với proton kề bên ở vị trí ortho.
Phổ HSQC(phụ lục 4)
Cho các tín hiệu của các proton và carbon tương tác trực tiếp.
Bảng 4.2: Dữ liệu phổ HSQC của Os01
Vị trí H 1H-NMR δppm ( số H, dạng mũi, J (Hz)) HSQC 1H → 13C 3 6.63 (1H,s) H-3 → C-3 6 6.16 (1H, d, J=2) H-6 → C-6 8 6.41 (1H, d, J=1.5) H-8 → C-8 2’ Xen phủ ở 7.38ppm H-2’ → C-2’ 5’ 6.86 (1H, d, J=8.5) H-5’ → C-5’
6’ Xen phủ ở 7.38ppm H-6’ → C-6’
Phổ HMBC (phụ lục 5):
•Cho tín hiệu tương tác giữa –OH kiềm nối và carbon carbonyl (δC = 181.6 ppm), giữa –OH kiềm nối và các carbon tứ cấp khác. Chứng tỏ có nhóm –OH trên C5 của khung flavonoid.
Từ những tính chất vật lý và dữ kiện phổ trên có thể suy luận Os01 là hợp chất có khung flavonoid.
Bảng 4.3 : Dữ liệu phổ 13
C-NMR và DEPT của Os01
Vị trí C 13C-NMR DEPT 90 DEPT 135 Kết luận 2 163.9 Biến mất Biến mất =C–O 3 102.8 Mũi dương Mũi dương –CH= 4 181.6 Biến mất Biến mất >C=O 5 161.5 Biến mất Biến mất =C–O 6 98.8 Mũi dương Mũi dương –CH= 7 164.1 Biến mất Biến mất =C–O
8 93.8 Mũi dương Mũi dương –CH= 9 157.3 Biến mất Biến mất =C–O 10 103.7 Biến mất Biến mất >C= 1’ 121.5 Biến mất Biến mất >C=
2’ 113.3 Mũi dương Mũi dương –CH= 3’ 145.7 Biến mất Biến mất =C–O 4’ 149.7 Biến mất Biến mất =C–O 5’ 116.0 Mũi dương Mũi dương –CH= 6’ 118.9 Mũi dương Mũi dương –CH=
Bảng 4.4 : Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC của Os01
Vị trí C/H 1 H-NMR δ ppm (số H; dạng mũi; J = Hz) 13 C-NMR δ ppm HMBC 1H → 13 C 2 163.9 3 6.63 (1H; s) 102.8 H-3 → C-2,10,1’ 4 181.6 5 161.5 6 6.16 (1H; d; J = 2) 98.8 H-6 → C-5,7,8,10 7 164.1 8 6.41 (1H; d; J = 1.5) 93.8 H-8→ C-6,7,9,10 9 157.3 10 103.7 1’ 121.5
2’ 7.38 (2H; dd; J = 2; 9) 113.3 H-2 → C-2,4’,6’ 3’ 145.7 H-3’ → C-1’,4’,5’
4’ 149.7
5’ 6.86 (1H; d; J = 8.5) 116.0 H-5’ → C-1’,3’,4’ 6’ 7.38 (2H; dd; J = 2; 9) 118.9 H-6’ → C-2,2’,4’
Các số liệu phổ của Os01 rất phù hợp với các số liệu của hợp chất: luteolin (3’,4’,5, 7- Tetrahydroxyflavone) đã được công bố trên tài liệu [57]
Bảng 4.5: So sánh dữ liệu phổ 13
C-NMR của Os01 với tài liệu tham khảo:
[57] Vị trí C Os01 Luteolin 2 163.9 164.2 3 102.8 103.6 4 181.6 182.4 5 161.5 162.7 6 98.8 99.0 7 164.1 164.5 8 93.8 99.4 9 157.3 158.1 10 103.7 104.7
1’ 121.5 123.1 2’ 113.3 113.5 3’ 145.7 145.8 4’ 149.7 149.4 5’ 116.0 116.0 6’ 118.9 119.5 - Từ những dữ liệu phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và một số tài liệu tham khảo suy ra cấu trúc của Os01trùng với cấu trúc Luteolin:
3’,4’,5,7-Tetrahydroxyflavone
4.2.2. Os02:
4.2.2.1. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA Os02:
- Dạng bột vô định hình màu trắng. - Tan trong MeOH, kết tinh trong MeOH.
- Sắc kí lớp mỏng (TLC) hiện màu bằng dung dịch axit H2SO4 10% trong EtOH.
9:1 cho vết màu nâu vàng Rf = 0.12 85:15 cho vết màu vàng nâu Rf = 0.44
Hình 4.3: Hợp chất Os02 Hình 4.4: Sắc kí lớp mỏng Os02 (Hệ dung môi CHCl3-MeOH 9:1)
4.2.2.2. NHẬN DANH CẤU TRÚC Os02:
Phổ 13C-NMR (phụ lục 7) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 8) cho thấy Os02 có 16 carbon gồm: 9 nhóm CH, 3 nhóm CH2, 1 nhóm CH3 và 3 carbon tứ cấp. Trong đó:
• Ba carbon olefin ở các độ chuyển dịch 113.048; 115.64; 120.31ppm.
•Hai carbon tứ cấp nối với oxy (=C-O) ở các độ chuyển dịch 144,98ppm và 148.90ppm
•Một carbon tứ cấp tại độ chuyển dịch 133.49ppm.
•Năm nhóm carbon metin nối với oxy (>CH-O) ở các độ chuyển dịch 100.34; 76.94; 76.82; 73.23; 69.72 ppm. Trong đó, đặc biệt là tín hiệu ở độ chuyển dịch 100.34 là tín hiệu của carbon anomer (O-C-O).
•Một nhóm CH2 alcen ở độ dịch chuyển 115.47 ppm.
•Một -CH2- của gốc anlyl δC = 39.1 ppm.
•Một carbon olefin ở độ chuyển dịch 137.84 ppm.
•Một nhóm methoxy CH3-O- ở độ chuyển dịch 55.68 ppm
Phổ 1H NMR (phụ lục 6) cho thấy các tín hiệu của tổng cộng 22 proton:
•Ba proton nhân thơm ở các độ chuyển dịch 7.00 ppm (1H, d, J = 8.3, H -6), 6.79 ppm (1H, d, J =1.9, H-3) và 6.66 ppm (1H, dd, J = 8.3; 1.9, H-5). Suy ra H-5 tương tác meta với H-3và tương tác ortho với H-6 trên vòng thơm.
•Các tín hiệu của năm proton trong vùng chuyển dịch 5.07 – 3.15 ppm cho thấy Os02 có chứa năm nhóm proton gắn trên carbon mang oxy (>CH-O)
•Tín hiệu của hai proton tại độ chuyển dịch 3.66 ppm (1H, ddd, J = 11.7; 5.2; 1.9) và 3.44 ppm (1H, dt, J = 11.9; 6.0) là tín hiệu của hai proton gắn trên carbon mang oxy.
•Tín hiệu tại độ chuyển dịch 5.02 ppm (2H, dtd, J = 3.2; 2.2; 1.1, H-3’’) và 5.94 ppm (1H, ddt, J = 16.8; 10.0; 6.7, H-2”) là tín hiệu của những proton vinil gắn trên carbon mang nối đôi
•Tại độ chuyển dịch 3.29 ppm (2H, d, J = 6.6, H-1”) là tín hiệu của hai proton gắn trên carbon kề carbon nối đôi (C=C-CH2-)
•Tín hiệu tại độ chuyển dịch 3.74 ppm (3H, s) là của proton trong nhóm methoxy (CH3-O-)
Phổ HSQC(phụ lục 9):
•Suy ra được các carbon tương tác trực tiếp với các proton đã biết từ phổ 1
H- NMR.
•Tín hiệu của hai proton tại độ chuyển dịch 3.66 ppm (1H, ddd, J = 11.7; 5.2; 1.9) và 3.44 ppm (1H, dt, J = 11.9; 6.0) là cùng cho tương tác với một carbon có độ
dịch chuyển là 60.69 ppm. Suy ra hai proton này cùng gắn trên một carbon mang oxy (CH2-O)
•Các proton cho tín hiệu trong phổ 1H-NMR nhưng không cho tín hiệu tương tác trực tiếp với carbon trong phổ HSQC. Suy ra chúng là những proton gắn trên dị nguyên tố khác (-O-H), cho tín hiệu tại các độ chuyển dịch 5.15; 5.07; 4.96; 4.48 ppm trong phổ 1
H-NMR.
Từ những dữ kiện trên có thể suy ra Os02 có cấu tạo gồm 3 phần: Một gốc anlyl, một vòng thơm bị thế ở 3 vị trí và một phân tử đường.
Phổ HMBC (phụ lục 10)
• Tín hiệu của proton ở độ chuyển dịch 4.84 ppm (1H, d, J =7.4, H-1’) cho tương tác với tín hiệu của carbon tứ cấp có nối với oxy (độ chuyển dịch 144.98, C1) suy ra phân tử đường gắn vào vị trí C-1 của nhân thơm.
• Tín hiệu của hai proton tại độ chuyển dịch 3.29 ppm (2H, d, J = 6.6, H-1’’) cho tương tác với các carbon số 3, 4, 5 của nhân thơm. Suy ra, gốc anlyl gắn vào vị trí C-4 của nhân thơm.
• Proton trong nhóm methoxy tương tác mạnh với C2. Do đó suy ra –OCH3
thế vào vị trí C-2 của nhân thơm.
O O O OHH O OHH O OHH O OHH O O
Ngoài ra, dữ liệu phổ 1
H-NMR của proton 1’ có độ chuyển dịch 4.84 (1H, d, J = 7.4). Giá trị của hằng số ghép J = 7.4 cho ta biết phân tử đường trên là đường β.
Những dữ liệu phổ trên của Os02 có nhiều điểm tương đồng với dữ liệu phổ của Eugenyl-β−D-glucoside (đã được cô lập từ cây hương nhu tía). Được công bố trên tài liệu[19, 51]
Bảng 4.6: Dữ liệu phổ 13C-NMR và phổ DEPT của Os02:
Vị trí C 13
C-NMR DEPT 90 DEPT 135 Kết luận 1 144.98 Biến mất Biến mất =C-O 2 148.90 Biến mất Biến mất =C-O 3 113.04 Mũi dương Mũi dương =CH- 4 133.49 Biến mất Biến mất =C< 5 120.31 Mũi dương Mũi dương =CH- 6 115.64 Mũi dương Mũi dương =CH- 1’ 100.34 Mũi dương Mũi dương =CH- 2’ 73.23 Mũi dương Mũi dương =CH- 3’ 76.82 Mũi dương Mũi dương =CH- 4’ 69.72 Mũi dương Mũi dương =CH- 5’ 76.94 Mũi dương Mũi dương =CH- 6’ 60.69 Biến mất Mũi âm -CH2-
1’’ 39.10 Biến mất Mũi âm -CH2- 2’’ 137.84 Mũi dương Mũi dương =CH-