vô hoạt cho từng chó thí nghiệm
Thí nghiệm Đối chứng
Chó 1 Chó 2 Chó 3 Chó 4 Chó 5 Chó 6
Vacxin CDV- VNUA-05 Tiêm nước cất
Liều 2ml 2 ml
Đường đưa vacxin
lần 1 Tiêm dưới da cổ bên trái Tiêm dưới da cổ bên trái Đường đưa vacxin
lần 2 Tiêm dưới da cổ bên phải Tiêm dưới da cổ bên phải
3.4.2. Quan sát, khám lâm sàng
Khám các chỉ tiêu lâm sàng bao gồm: Nhiệt độ, tần số hô hấp, tần số tim mạch, độ mất nước, quan sát những thay đổi về trạng thái, phản xạ... để xác định các triệu chứng sốt, ủ rũ, bỏ ăn, ho khạc, nôn mửa, ỉa chảy, xuất hiện nốt sài ở các vùng da mỏng và triệu chứng thần kinh.
22
Thân nhiệt : dùng nhiệt kế đưa vào trực tràng của chó thí nghiệm và giữ trong vòng 2 đến 5 phút. Đo nhiệt độ hàng ngày, mỗi ngày chúng tôi tiến hành đo hai lần vào buổi sáng (8h) và buổi chiều (17h).
Tần số hô hấp: đếm số lần lên xuống của hõm hông thành bụng của chó thí nghiệm trong 1 phút, đếm lại hai lần rồi lấy kết quả trung bình ba lần đếm.
Tần số tim: dùng ống nghe nghe vùng tim trái của chó thí nghiệm trong một phút, nghe lại hai lần và lấy kết quả trung bình ba lần nghe.
3.4.3. Phƣơng pháp lấy máu để kiểm tra các chỉ tiêu
Chúng tôi lấy máu chó vào các ngày 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 sau khi tiêm vacxin để kiểm tra các chỉ tiêu huyết học bằng cách dùng kim tiêm vô trùng lấy 2ml máu ở tĩnh mạch khoeo hoặc tĩnh mạch bàn của chó thí nghiệm cho vào ống chống đông để nghiêng khoảng 30 độ, xoay nhẹ ống. Sau đó đo chỉ tiêu huyết học bằng máy CELL-DYN 3700.
Chúng tôi tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý máu bao gồm: số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, hàm lượng huyết sắc tố, tỷ khối huyết cầu, thể tích trung bình hồng cầu, lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu.
3.4.4. Xác định hàm lƣợng kháng thể có trong máu
Chúng tôi tiến hành lấy máu chó thí nghiệm vào các ngày 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 sau khi tiêm vacxin để xét nghiệm hàm lượng kháng thể có trong cơ thể chó thí nghiệm bằng phương pháp ELISA.
Các bước thực hiện phản ứng ELISA như sau:
Bước 1: Chuẩn bị các dụng cụ của bộ test ELISA để ở nhiệt độ phòng ít nhất là 1 giờ. Lấy từ trong túi ra tấm dụng cụ có các giếng có tấm kháng thể.
Bước 2: Bổ sung 100µl mẫu pha loãng vào trong các giếng.
Bước 3: Bổ sung thêm 100µl thuốc thử đối chứng dương và đối chứng âm vào các giếng xác định.
Bước 4: Ủ tấm kháng nguyên trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 5: Rửa tấm phủ kháng nguyên sau khi ủ ở bước 4, 4 lần bằng máy rửa tự động ELISA.
Bước 6: Quá trình rửa hoàn tất khi dùng khăn giấy lau nhẹ để loại bỏ hoàn toàn bộ đệm còn sót lại.
Bước 7: Thêm 100µl Conjugate vào từng giếng và ủ ấm trong vòng 10 phút.
Bước 8: Rửa tấm kháng nguyên ở bước 7 như rửa ở bước 5 và bước 6.
Bước 9: Thêm 100µl TMB substrate. Ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng nếu phản ứng dương tính tấm phủ kháng nguyên s nổi rõ màu xanh lá cây.
Bước 10: Thêm 100µl TMP vào mỗi giếng để dừng phản ứng.
Bước 11: Đọc kết quả: Độ hấp thụ quang (OD) bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm.
- Nếu OD > Cut – off: dương tính - Nếu OD < Cut – off: âm tính
3.4.5. Phƣơng pháp RT – PCR
Phương pháp RT – PCR được tiến hành nhằm mục đích kiểm tra sự có mặt của virus Care và một virus khác trong cơ thể chó thí nghiệm. Bước đầu của phản ứng RT – PCR là quá trình phiên mã ngược từ khuôn mẫu mRNA tạo ra sợi đơn cDNA, các bước sau tiến hành giống phản ứng PCR.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ được lặp đi lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:
Bước 1: Phân tử DNA được biến tính ở 94 – 95ºC trong khoảng thời gian từ 30 giây đến 1 phút, trong quá trình biến tính DNA sợi kép được giãn xoắn thành 2 chuỗi DNA mạch đơn.
Bước 2: Là giai đoạn mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn hay còn gọi là giai đoạn lai. Nhiệt độ để mồi bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn thường từ 40 – 47 ºC, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút tùy thuộc vào mồi và DNA sợi khuôn tương ứng.
Bước 3: Giai đoạn tổng hợp nên đoạn DNA mới. Ở giai đoạn này nhiệt độ
được nâng lên 72 ºC, đây là nhiệt độ thích hợp nhất cho DNA polymerase hoạt
động để tổng hợp nên sợi DNA mới trên cơ sở mồi đã được bắt cặp bổ sung với DNA sợi khuôn. Thời gian cho bước này có thể kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại.
3.4.6. Phƣơng pháp công cƣờng độc
Sử dụng chủng CDV- HUA- 04H được bảo quản tại phòng thí nghiệm
trọng điểm công nghệ sinh học khoa Thú y, có hiệu giá virus là 6,25 x 105
TCID50 để công cường độc cho chó thí nghiệm.
24
Lấy 1 ml chủng CDV- HUA- 04H có liều 100 LD50 được tiêm tĩnh mạch chó sau 21 ngày tiêm vacxin lần 2.
Triệu chứng lâm sàng của các chó được theo dõi hàng ngày và ghi lại sau 21 ngày công cường độc. Mẫu máu và dịch swab được lấy ở các ngày thứ 4, 7, 10, 14, 21 ở tất cả chó thí nghiệm và đối chứng sau khi công cường độc để kiểm tra huyết thanh học và phân lập virus.
3.4.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Microsoft Office Excel 2010.
- Giá trị trung bình
n: là dung lượng mẫu Ẍ: là số trung bình mẫu Xi: là giá trị quan sát được - Độ lệnh chuẩn: (SX) X S = 1 ) ( n X Xi với n30 SX= n X Xi ) ( với n30 - Sai số trung bình: (mX ) mX= 1 n SX với n30 mX= n SX với n30 download by : skknchat@gmail.com
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN CHÓ THÍ NGHIỆM CHO TIÊM VACXIN VÔ HOẠT CARE TIÊM VACXIN VÔ HOẠT CARE
4.1.1. Hàm lƣợng kháng thể kháng CDV của chó thí nghiệm
Trước khi tiêm vacxin, chó được theo dõi trong vòng 7 ngày thấy chó khỏe mạnh, ăn uống bình thường, không sốt, không có ỉa chảy. Tiến hành lấy máu của 6 chó thí nghiệm, chắt huyết thanh kiểm tra sự tồn tại kháng thể kháng CDV bằng phương pháp ELISA. Kết quả được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1. Hàm lƣợng kháng thể kháng CDV của chó thí nghiệm
Phân lô STT chó OD Cut-off Kết quả
Lô thí nghiệm 1 0,02 0,3 - 2 0,04 - 3 0,02 - Lô đối chứng 4 0,03 - 5 0,03 - 6 0,02 -
Ghi chú: + Dương tính; - Âm tính
OD (Optical Density): mật độ quang học; Cut off: giá trị tới hạn
So sánh OD với Cut-off: nếu OD>Cut-off: Dương tính OD<Cut-off: Âm tính
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy, cả 6 chó được lựa chọn cho thí nghiệm đều không có kháng thể kháng CDV trong máu và các chó này đều chưa được tiêm phòng vacxin Care hay có kháng thể từ mẹ. Kháng thể có nguồn gốc từ mẹ được coi là nguyên nhân đầu tiên có thể tác động tiêu cực tới sự hình thành đáp ứng
miễn dịch ở chó con (Wilson et al.,2014). Như vậy, 6 có thí nghiệm không có
khả năng bảo hộ cho chó khi bị CDV tấn công. Do đó, các chó trong nghiên cứu này đảm bảo các điều kiện tối ưu để tiến hành khảo sát đáp ứng miễn dịch ở chó khi tiêm vacxin Care vô hoạt.
4.1.2. Kiểm tra sự có mặt của virus CDV và một số virus khác trong cơ thể chó trƣớc khi tiến hành thí nghiệm chó trƣớc khi tiến hành thí nghiệm
Trước khi tiến hành thí nghiệm, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự có mặt của virus CDV và một số virus, vi khuẩn khác (virus dại, vi khuẩn Leptospira, virus
26
viêm gan, parvovirus) bằng phương pháp RT – PCR. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2.