Tên sản phẩm được tạo thành qua mỗi bước được liệt kê trong bảng 3.1. Bảng 2.6. Tên các mẫu
STT Tên mẫu Chú thích
1 PDMS Màng PDMS phủ trên đế silic
2 PDMS UVO Màng PDMS sau khi xử lý UVO
3 PDMS amin PDMS UVO chức năng hóa bằng APTES có nhóm amin trên bề mặt
4 PDMS carboxyl PDMS UVO chức năng hóa bằng SAA có nhóm carboxyl trên bề mặt
5 Thẻ SPA Đế PDMS carboxyl đã được cố định ADN đầu dò lên bề mặt
1. Xử lí bề mặt mẫu trước khi quay phủ PDMS - Rung siêu âm đế silic trong axeton trong 10 phút; - Rung siêu âm đế silic trong cồn trong 10 phút;
- Rung siêu âm đế silic trong dung dịch nước cất trong 10 phút; - Làm khô đế bằng khí nitơ;
- Nung mẫu ở nhiệt độ 100oC trên bếp nung trong 10 phút. 2. Tạo màng PDMS
- Trộn hỗn hợp monome prePDMS và chất làm đóng rắn curing theo tỉ lệ PDMS : chất đóng rắn là 10:1 (v/v);
- Trộn đều trong vòng 2 phút.
- Hút chân không 15 phút bằng máy hút chân không, sau đó tắt bật 5 lần; - Nhỏ hỗn hợp trên lên đế silic;
- Hút chân không 15 phút, sau đó tắt bật 5 lần;
- Quay phủ đế bằng thiết bị quay phủ với tốc độ quay phủ 6000 rpm/phút, trong 10 phút;
- Ủ mẫu đã quay phủ ở 70oC trong 1 giờ để PDMS đóng rắn tạo lớp màng trên bề mặt đế;
- Rửa đế 5 lần bằng ethanol;
- Làm khô đế bằng khí nitơ và bảo quản đế trong đĩa petri bọc parafil ở nhiệt độ phòng.
3. Xử lý bề mặt màng PDMS bằng phương pháp Ultraviolet-Ozone - Đặt đế đã quay phủ PDMS vào trong thiết bị UVO Cleaner; - Đặt chế độ cho máy như sau: Clear 20 phút, hút khí 10 phút. - Đế sau khi xử lý bằng máy UVO gọi là đế Si.PDMS.UVO. 4. Amin hóa bề mặt đế Si.PDMS.UVO bằng APTES
- Chuẩn bị dung dịch APTES 5%
Chuẩn bị 5ml dung dịch 5% nước trong ethanol tỉ lệ (v/v). Đưa pH dung dịch đến giá trị trong khoảng 4.5-5 bằng axit axetic;
Hòa tan 0.25ml APTES vào dung dịch trên đến nồng độ 5% (v/v);
Giữ dung dịch trên trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để APTES thủy phân tạo silanol.
- Amin hóa bề mặt đế
Nhúng đế Si.PDMS.UVO vào dung dịch silanol trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ phòng;
Rửa đế 5 lần trong ethanol; Ủ mẫu ở 100oC trong 1 giờ.
Màng PDMS.UVO đã amin hóa bằng APTES được gọi chung là “màng PDMS amin”.
Trên đế silic đã chức năng hóa bằng APTES có nhóm amin trên bề mặt, dùng Succinic acid anhydride (SAA) để làm biến đổi bề mặt có chứa nhóm amin thành nhóm cacboxyl theo quy trình:
- Hòa tan SAA trong nước với nồng độ 10,5mg SAA trong 500µl nước, chuẩn pH 6 bằng 30µl NaOH 3M. Dung dịch này gọi là dung dịch SAA;
- Nhỏ 200ul dung dịch SAA lên đế;
- Để trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trong đĩa Petri. Để giảm lượng bay hơi của dung dịch SAA trên đếcó thể nhỏ dung dịch SAA xung quanh các mẫu nhằm làm tăng độ ẩm môi trường xung quanh;
- Loại bỏ dịch tan sau phản ứng và ngâm đế với đệm PBS trong vòng 15 phút nhằm loại bỏ SAA dư;
- Rửa sạch đế bằng nước deion và làm khô đế bằng khí nitơ. Đế chứa màng PDMS cacboxyl được gọi là đế PDMS carboxyl.
6. a) Cố định ADN đầu dò lên đế PDMS carboxyl bằng phương pháp hấp phụ vật lý
- Rửa đế PDMS carboxyl bằng đệm MES 100mM;
- Nhỏ lên mỗi đế 4 giọt ADN mỗi giọt có thể tích 15 µl nồng độ 0.25µg/µl, 1.0µg/µl, 2.0µg/µl, 3.0µg/µl;
- Để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ;
- Thu lại dịch tan trên đế, đo và bù lại thể tích bằng dung dịch MES để phân tích lượng ADN dư sau phản ứng;
- Rửa đế bằng nước deion;
- Xì khô đế bằng khí nitơ, bảo quản trong đĩa petri. Thí nghiệm đối chứng:
- Nhỏ lên đế PDMS cacboxy 15µl dung dịch MES 100mM. - Sau 2 giờ hút dung dịch ra khỏi đế và rửa lại bằng nước deion.
b) Cố định đầu dò SPA lên đế PDMS carboxyl bằng phương pháp hóa học
ADN được cố định lên đế carboxyl bằng phương pháp hóa học nhờ sử dụng chất nối 1–Ethyl–3–(3–dimethylaminipropyl) carbodiimide (EDC). Chất này kích hoạt nhóm –COOH trên bề mặt đế để có thể phản ứng được với nhóm amin trên đầu dò SPA.
- Nhỏ lên mỗi đế 4 giọt ADN mỗi giọt có thể tích 15ul nồng độ 0.25µg/µl, 1.0µg/µl, 2.0µg/µl, 3.0µg/µl;
- Cân 1mg EDC vào eppendorf mới;
- Hòa tan eppendorf chứa 1mg EDC với 24ul MES 100mM; - Mix đều và chia đều 2ul ra cho mỗi giọt đặt phản ứng; - Sau 2 giờ hút dung dịch ra khỏi đế, đong và bù thể tích; - Rửa lần 1 bằng 15ul MES 100mM;
- Rửa lại bằng nước deion.
Đế PDMS carboxyl được cố định đầu dò SPA được gọi là thẻ SPA. Diện tích bề mặt tiếp xúc của 15µl dung dịch SPA với đế PDMS carboxyl (có kích thước thực tế là 1 cm x 1 cm) là 0.114 cm2 (hình 2.2).