VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
Kháng thể scFv đã được sàng lọc trong thư viện bằng kỹ thuật phage display,
có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên HA của virus cúm gia cầm A/H5N1 do phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp. Mẫu kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 được cung cấp bởi phòng Vi sinh phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học công nghệ Việt Nam.
Hóa chất: muối vàng chloroauric (HAuCl4, 99,9%, Roth), natri citrate
(C6H5O7Na3, 99,9%, Roth),nước khử ion, và các hóa chất thơng dụng trong sinh học
phân tử được cung cấp bởi các hãng.
Các thiết bị: Bếp khuấy từ, máy li tâm, thanh khuấy từ, bình tam giác, ống
nghiệm thủy tinh, màng nitrocellulose, máy ảnh, pipette, găng tay, máy đo độ pH.
2.2.Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Phương pháp chế tạo dung dịch nano vàng (AuNPs)
Phương pháp tổng hợp Turkevich[58] dựa trên nguyên tắc khử ion Au3+ bằng natri citrate được ông và các cộng sự tiến hành năm 1951, đây là phương pháp khử hóa học thuận tiện có thểtổng hợp dung dịch hạt nano vàng thể huyền phù với các hạt
đơn phân tán, có kích thước dao động ~ 20nm. Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra các hạt nano vàng hình cầu với độ phân tán cao, quá trình khử bằng citrate sẽ tạo ra một lượng ion(–) citrate bám xung quanh hạt nano bằng lực hút tĩnh điện làm cho bề mặt của chúng được tách rời nhau ngăn cản chúng liên kết với nhau để tạo thành những hạt lớn hơn, các hạt AuNPs sau khi được tổng hợp sẽ có sẵn những nhóm chức carboxyl (–COOH ) sẵn trên bề mặt. Về mặt sinh học, đây là một ưu điểm rất thuận lợi để có thể gắn các hạt nano với các phân tử sinh học như DNA, RNA, các phân tử kháng thể... mà không cần qua một q trình biến tính hóa học phức tạp nào khác và có thể được dùng trong các ứng dụng chế tạo kit chẩn đoán nhanh một số loại bệnh, các ứng dụng khác có liên quan.
Phương trình phản ứng và cơ chế phản ứng cho việc khử ion Au3+ thành Au0
được minh họa như bên dưới:
2 HAuCl4+ 4 Na3C6H5O7H2+ 2 Au0+ 4 CO2 + 4NaC5H5O5+ 8NaCl Tiến trình của phản ứng:
1. HAuCl4+ Na3C6H5O7 Na2C6H6O7+ AuCl3 2. HAuCl4+ Na2C6H6O7 NaC6H6O7– AuCl2
3. NaC6H6O7 – AuCl2 + Na3C6H5O7 CO2 + Na2C6H6O7+ NaC5H5O5+ AuCl – NaCl
– NaCl
4. Na2C6H6O7+ AuCl NaC6H6O7 – Au
5. 2 NaC6H6O7– Au H2+ 2Au0+ 2CO2+ 2 NaC5H5O5
Sau đó các hạt nano vàng sẽ được hình thành thông qua các giai đoạn: hình
thành nhân, mọc thành hạt và sự ổn định hạt.
Q trình chế tạodung dịchAuNPs có thể được minh họa theo sơ đồ sau:
Hình 2.1. Sơ đồ phản ứng hóa học tạo hạt nano vàng theo phương pháp khử của Turkevich [64].
Cơ chế của phản ứng:
Khi bắt đầu hình thành nhân (nucleation) của phản ứng, tất cả các hạt nano vàng ở kích thước rất nhỏ và đồng đều nên dung dịch có màu tím sẫm. Tuy nhiên sự cực tiểu hóa năng lượng bề mặt khiến các hạt này trở nên co cụm và tập trung vào nhau. Tại cùng thời điểm đó các ion citrate tích điện âm được giải phóng trong suốt q trình khử gắn vào bề mặt của hạt nano vàng và ngăn cản các hạt tiếp tục co cụm lại với nhau. Các ion citrate đóng vai trò chất hoạt động bề mặt và kìm hãm sự co cụm của các hạt nano vàng, nếu dung dịch được khuấy liên tục và giả thiết rằng dung dịch là đồng nhất thì các hạt nano sẽ tiếp tục co cụm với nhau và phát triển cho tới khi tất cả diện tích bề mặt của hạt nano vàng được bọc hoàn toàn bởi các ion citrate, tại thời điểm này kích thước các hạt sẽ khơng tăng thêm nữa. Do đó, nếu có càng nhiều ion citrate thì chúng sẽ có thể che phủ bề mặt lớn hơn của các hạt nano vàng, điều này
đồng nghĩa với việc tạo ra các hạt nhỏ hơn. Do đó, việc thay đổi lượng citrate trong
phản ứng có khả năng được dùng để kiểm sốt kích thước hạt nano vàng.
Hình 2.2. Kích thước và hình dạng của hạt nano vàng theo thời gian phản ứng trong khoảng thời gian t=10giây đến t=120giây [19].
Sự thay đổi màu của dung dịch quan sát được trong suốt thời gian phản ứng là do việc hấp thụ photon do cộng hưởng Plasmon bề mặt của các hạt nano vàng trong vùng ánh sáng nhìn thấy. Hiện tượng này chỉ xảy ra ở ranh giới của chất dẫn điện (nano vàng) và chất dẫn điện. Tùy thuộc vào kích thước, thành phần hóa học, hình thái của bề mặt, tương của dao động Plasmon với photon sẽ khác nhau. Các photon với bước sóng xác định sẽ được truyền qua, hay hấp thụ và bị phản xạ. Đặc tính này chỉ xảy ra trong kích thước nano mét, đối với hạt nano vàng nhỏ hơn 100 nm, bước sóng ánh sáng bị phản xạ sẽ rơi vào trong khoảng ánh sáng nhìn thấy. Khi càng giảm kích thước hạt, các bước sóng lớn hơn sẽ bị phản xạ, và màu của hạt sẽ dịch tới khu vực cuối của violet của dải ánh sáng nhìn thấy.
Mục đích của chúng tơi là chế tạo được dung dịch AuNPs thể huyền phù với các hạt có kích thước ~ 20 nm có gắn sẵn nhóm chức –COOH trên bề mặt hạt nano để sẵn sàng gắn với các phân tử kháng thể đồng thời màu đỏ đặc trưng của dung dịch nano do hiệu ứng cộng hưởng plasmon phải đủ độ “mạnh” cho mục đích đánh dấu sinh họcvới mật độ hạt nhất định, màu đỏ đặc trưng của dung dịch sẽ đóng vai trị như một sensor màu.
Quy trình tổng hợp hạt AuNPs như sau:
- Dùng pipette nhỏ 100 µl dung dịch muối vàng chloauric (HAuCl4) 5% vào một bình tam giác chứa 80 ml nước khử ion. Bình được đặt trên bếp khuấy từ gia nhiệt
và đun đến khi dung dịch bắt đầu sôi.
- Thanh khuấy từ được đặt trong bình tam giác khi bắt đầu phản ứng và khuấy ở 1200 vòng/phút. Nhỏ lượng dung dịch natri citrate (C6H5O7Na3) 1% thích hợp vào trong bình khi tiếp tục gia nhiệt. Phản ứng bắt đầu xảy ra.
- Trong khoảng 20 giây, dung dịch bắt đầuchuyển sang màu tím sẫm. Tại thời điểm này phản ứng kết tủa các hạt Au0đã bắt đầu hình thành.
- Tiếptục gia nhiệt và khuấy trong 20phút. Trong suốt thời gian phản ứng này, màu của dung dịch sẽ chuyển sang sẫm màu hơn giữa tím và da cam tùy thuộc vào tỉ số giữa C6H5O7Na3và HAuCl4được sử dụng trong phản ứng.
- Khi phản ứng đã đạt tới thời gian sau 20 phút, chuyển ngay bình phản ứng ra khỏi bếp khuấy từ và nhúng ngay vào nước đá. Khi bị làm lạnh đột ngột, phản ứng hóa học sẽ dừng lại và kích thước hạt sẽ khơng bị thay đổi nhiều.
Sự tồn tại của các hạt keo vàng có thể được nhận ra bởi việc chiếu chùm tia laser phân cực và dung dịch. Khi chùm tia phân cực chiếu vào dung dịch, chúng ta có thể nhìn thấy chùm sáng theo một hướng nhất định, nó sẽ biến mất nếu quan sát theo một hướng trực giao với phương vừa quan sát.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu các nhân tố ảnh hướng đến chất lượng mẫu
Để đánh giá chất lượng của mẫu dung dịch nano vàng với các thống số kỹ
thuật phù hợp cho công việc của luận văn như: kích thước hạt đồng đều, hiệu ứng
màu đặc trưng của dung dịch trên hiện tượng cộng hưởng plasmon, độ bền của dung
dịch theo thời gian…chúng tôi đã nghiên cứu sự phụ thuộc của chúng vào các điều kiện phản ứng khác nhau như: thời gian phản ứng, thay đổi lượng chất khử natri citrate, thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản.
2.2.2.1. Thời gian phản ứng
Chúng tôi tiến hành tổng hợp các dung dịch AuNPs khác nhau với cùng lượng muối vàng HAuCl4, chất khử Na3C6H5O7Na3 nhưng trong các khoảng thời gian phản
ứng khác nhau, thay đổilần lượt trong khoảng từ 2 đến 40phút phản ứng. Bảng 2.1 là các phản ứng tạo hạt vàng với các thời gian khác nhau.
Bảng 2.1. Tổng hợp hạt nano vàng với các khoảng thời gian phản ứng khác nhau
Mẫu H2O (ml) HAuCl4 5% (µl) Na3C6H5O7Na3
1% (ml) Thời gian phản ứng (phút) No1 80 100 3,5 2 No2 80 100 3,5 5 No3 80 100 3,5 7 No4 80 100 3,5 9 No5 80 100 3,5 12 No6 80 100 3,5 15 No7 80 100 3,5 20 No8 80 100 3,5 30 No9 80 100 3,5 40
2.2.2.2. Thay đổi lượng chất khử Na3C6H5Na3
Để kiểm tra ảnh hưởng của lượng chất khử natri citrate, chúng tôi cũng tiến hành các phản ứng tạo nano vàng với các lượng chất khử khác nhau (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Thay đổi lượng chất khử lượng Na3C6H5Na3khác nhau
Mẫu H2O (ml) HAuCl4 (5%) (µl) Na3C6H5O7Na31%
(µl) Thời gian phản ứng (phút) N1 80 100 700 20 N2 80 100 1.5 20 N3 80 100 3.5 20 N4 80 100 5 20 N5 80 100 9 20 N6 80 100 12 20
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu kích thước, hình thái và cấu trúc hóa họccủa AuNPs. của AuNPs.
Các mẫu nano vàng sau khi chế tạo được phân tích bằng hiển vi điện tử quét (SEM), phân tích thành phần EDX, phổ hấp thụ UV-vis, phổ hồng ngoại FTIRnhằm tìm hiểu hình dạng, kích thước, cấu trúc hóa học của hạt nano vàng cũng như phân
tích được thành phần của vật liệu sau khi chế tạo.
2.2.3.1. Phân tích bằng phổ hấp thụ UV
Nguyên lý của phương pháp được mô tả như sau: chiếu một chùm tia đơn sắc
có cường độ I0 vào một môi trường vật chất độ dày 1 cm và nồng độ C (mol/l), chùm tia này bị môi trường vật chất này hấp thụ và truyền qua. Cường độ I của chùm tia truyền qua môi trường này sẽ bị giảm theo quy luật Beer-Lamber (Khi hấp thụ tia đơn sắc , độ hấp thụ phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ chất hấp thụ. Tùy từng chất, định luật Beer-Lamber thường đứng trong một khoảng nồng độ).
Log(I0/I ) = K.n hay là log(I0/I) = ε 1C
Trong đó K là hệ số hấp thụ mol hay độ hấp thụ của môi trường, n là số mol chất cần đo đặt trên đường đi của tia bức xạ.
Đại lượng log(I0/I ) được gọi là mật độ quang học D hoặc độ hấp thụ A.
ε là hệ số hấp thụ mol có giá trị bằng mật độ quang của dung dịch khi nồng độ chất
hấp thụ bằng một đơn vị và độ dày chất hấp thụ bằng một đơn vị. Hệ số hấp thụ chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất hấp thụ và bước sóng của bức xạ bị hấp thụ. Độ truyền qua của môi trường là T= I/I0.
Hình 2.3. Sơ đồ máy đo phổhấp thụ UV/vishai chùm tia
Sự hấp thụ thường tập trung vào từng vùng phổ hẹp nên người ta hay dùng các vùng phổ hẹp như vùng nhìn thấy, vùng tử ngoại, vùng hồng ngoại…
Đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ Kv vào tần số ν hoặc
bước sóng tới λ gọi là đường cong hấp thụ (phổ hấp thụ). Mỗi chất hấp thụ đều hấp thụ lọc lựa ở những tần số sóng khác nhau.
2.2.3.2. Phân tích bằng hiển vi điện tử quét (SEM)
Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy) là thiết bị phân tích hữu hiệu cho vật liệu nano. SEM cho phép chúng ta biết những thơng tin về địa hình, hình thái học, thành phần, thơng tin tinh thể học. Chữ “quét” (scanning) ở đây để thể
đặc tính quét tia điện tử trên mẫu để quan sát vùng tại điện tử quét qua. Sơ đồ cấu tạo
của kính hiển vi điện tử có thể mơ tả như hình 2.4.
Hình 2.4. Sơ đồ minh họa cấu tạo của kính hiển vi điện tử quét
Nguyên lý hoạt động của SEM: Một dòng tia điện tử được tạo ra bằng một
nguồn phát điện tử (Electron source) và được gia tốc đến mẫu nhờ việc sử dụng một hiệu điện thế dương, dòng điện tử này được giam giữ và hội tụ nhờ sử dụng các độ
mở kim loại. Sau đó, chùm tia điện tử đơn sắc được hội tụ và quét lần lượt lên bề mặt mẫu thành những đường riêng lẻ (giống như nguyên lý quét của ti vi). Khi các điện tử
đến va chạm với mẫu dẫn đến các phản ứng khác nhau xảy ra trong mẫu. Các tương
tác này sẽ được ghi nhận và chuyển thành hình ảnh bằng nhiều công cụ hỗ trợ khác
nhau. Trước khi chuyển sang điểmquét tiếp theo của bề mặt mẫu, các thiết bị hỗ trợ sẽ tính tốn số các tương tác và hiển thị chúng thành một pixel trên màn hình. Quá trình này sẽ lặp đi, lặp lại cho đến khi kết thúc. Trên thiết bị TEM hoặc SEM thường tích hợp thiết bị phân tích thành phần vật liệu bằng phương pháp phân tích phổ tán xạ tia X –EDX (Energy Dispersive X-ray). Nguyên lý của phương pháp dựa trên tác
động của chùm tia electron lên bề mặt mẫu, tương tác này làm phát ra tia X, năng lượng photon của tia X là đặc trưng cho từng nguyên tố mà chỉ riêng nó mới có.
Chính vì thế mà có thể biết được chính xác thành phần hóa học các chất có bên trong mẫu. Thậm chí, phân bố thành phần theo từng diện tích xác định, vì tia điện tử từ
nguồn phát điện tử sê quét theo từng khu vực cụ thể. Hệ thống vi phân tích sẽ thu thập tia X, sắp xếp thứ tự, phân bố chúng thành giản đồ năng lượng, tự động gán tên của từng thành phần hóa học có bên trong mẫu tương ứng với những đỉnh của phân bố năng lượng.
Mẫu được phân tích bằng máy S- 4800 FESEM- Viện Khoa học Vật liệu và
Trung tâm đánh giá sai hỏngvật liệu, Viện Khoa học Vật liệu.
2.2.3.3. Phân tích bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FTIR
Phổ hấp thụ hồng ngoại chính là phổ dao động quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì cả chuyển động dao động và chuyển động quay đều bị kích thích. Tất cả các phân tử được cấu tạo từ các nguyên từ các nguyên tử nối với nhau bằng các liên kết hóa học. Dao động của các nguyên tử liên kết hóa học giống như dao động của hệ thống các quả cầu nối với nhau bằng các lò xo. Chuyển động của các quả cầu lị xo này có thể coi là kết quả của sự chồng chập hai dao động: kéo căng và uốn cong.
Tần số dao động không chỉ phụ thuộc và bản chất của từng liên kết riêng biệt
như: C-H hay C-O, mà còn phụ thuộc và cả phân tử và mơi trường xunh quanh nó. Tương tự như hệ các quả cầu tự do, cả hệ thống tác động lên dao động của các điện tích
cũng tăng lên dưới sự va đập. Tương tự như vậy, biên độ dao động của các liên kết hóa học và cùng với chúng là dao động của các điện tích cũng tăng lên khi trường điện tử
tác động lên chúng. Sự khác nhau giữa hệ cầu lò xo và phân tử nằm ở mức năng lượng
của dao động phân tử lượng tử hóa. Do đó các phân tử chỉ hấp thụ các bước sóng trong phổ hồng ngoại có năng lượng tương ứng với khoảng cách giữa hai mữc năng lượng
dao động của nguyên tử. Do đó, biên độ dao động tăng theo kiểu nhảy bậc. Đối với các
phân tử có nhiều nguyên tử, dao động quay thường rất phức tạp, tuy nhiên, có thể quy một chuyển động phức tạp thành một số những dao động đơn giản hơn gọi là dao động riêng. Mỗi dao động riêng lại có mức năng lượng nhất định. Trường hợp 2-3 dao động có cùng một mức năng lượng gọi là dao động suy biến.
Hình 2.5. Mơ hình một máy quang phổ FTIR cơ bản
Người ta phân biệt dao động riêng thành hai loại:
1. Dao động hóa trị (ký hiệu là υ) là những dao động làm thay đổi góc liên kết
2. Dao động biến dạng (ký hiệu là δ) là những dao động làm thay đổi góc liên kết nhưng khơng làm thay đổi chiều dài liên kết của các nguyên tử trong phân tử.
Mỗi loại dao động còn được phân chia thành daođộng đối xứng (ký hiệu là υs
và δs) và bất đối xứng (ký hiệu là υasvà δas).
Cường độ và hình dạng phổ:
Phổ hồng ngoại được ghi dưới dạng đường cong sự phụ thuộc của phần trăm truyền qua (100I/I0) vào số sóng. Sự hấp thụ của các nhóm nguyên tử được thể hiện