Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.3. TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM
Theo Nguyễn Vĩnh Phước và cs. (1978), tổn thương do virus gây ra tại cửa vào không gây triệu chứng bệnh (thời kỳ nung bệnh); thời gian nung bệnh rất khác nhau phụ thuộc vào độc lực của virus, số lượng virus và đường xâm nhập, thời gian nung bệnh ngắn 2 - 3 ngày, có khi lên tới 10 - 14 ngày, những trường hợp liều gây nhiễm thấp thời gian nung bệnh đối với chu kỳ đầu tiên có thể dài hơn.
Thời gian nung bệnh từ 2 - 5 ngày, trung bình 3 - 5 ngày có khi chỉ 16 giờ. Khi bệnh bắt đầu xuất hiện thì con vật sốt 40 - 41oC liên tục 2 - 3 ngày, ủ rũ, lông dựng, đầu mũi khô, sản lượng sữa giảm, dáng điệu mệt mỏi, lừ đừ, kém ăn, thỉnh thoảng nằm gục đầu xuống, tai và đi khơng phe phẩy, nằm xuống đứng lên có vẻ khó khăn, nặng nề, chậm chạp (Cục thú y, 2003).
Nguyễn Tuấn Anh (2010), đã tiến hành khảo sát một số đặc điểm dịch tễ bệnh LMLM ở trâu, bò tại tỉnh Lâm Đồng giai đoạn 2004 - 2009 và cho biết: từ 2004 - 2006, dịch liên tục xảy ra; tuy nhiên từ 2007 đến 2009 hầu như khơng có dịch trên địa bàn nghiên cứu.
Nguyễn Ngọc Tiến (2010) cho biết: tỷ lệ lưu hành huyết thanh LMLM tại Thái Bình là 8,62%; tại Nam Định là 7,67%. Huyết thanh dương tính được phát hiện ở tất cả 17 huyện, thành phố thuộc tỉnh Nam Định và tỉnh Thái Bình.
Cục thú y (2011) cho biết: Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1898 tại Nha Trang và sau đó dịch đã xảy ra ở các tỉnh Trung và Nam Bộ (trong thời gian này bệnh cũng được phát hiện ở cả Lào, Campuchia và Thái Lan).
Theo số liệu thống kê của Cục thú y (2011), từ năm 1976 - 1983, đã có 98 ổ dịch ở các tỉnh phía Nam, làm 26.648 trâu, bị và 2.919 lợn bị bệnh. Riêng trong năm 1983, các ổ dịch từ trâu, bò đã lan sang một trại lợn công nghiệp ở huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng Nai làm hơn 2.200 con lợn bị mắc bệnh.
Cục thú y (2011) cho biết: năm 1999, trong khi vẫn chưa chấm dứt các đợt dịch từ các tỉnh miền Trung và miền Nam thì ở miền Bắc, đợt dịch mới từ Trung Quốc tràn sang tấn công hàng loạt các tỉnh giáp biên. Cao Bằng là điểm dịch đầu
tiên, từ đó dịch lan sang các tỉnh khác. Tính đến ngày 10/3/2000 cả nước có 58/61 tỉnh, thành phố bị dịch với 297.808 trâu, bò và 36.530 lợn mắc bệnh.
Năm 2012, Phạm Anh Hùng đã nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ và xác định type virus gây bệnh LMLM ở trâu, bò tại tỉnh Lai Châu và cho biết: trong 6 năm (2006 - 2011), dịch LMLM đã liên tục xảy ra tại tỉnh Lai Châu. Bệnh xuất hiện ở tất cả các mùa trong năm nhưng tập trung hơn vào vụ Đông - Xuân.
Nguyễn Hải Sơn (2012) cho biết: bệnh LMLM tại Quảng Ninh xảy ra liên tục từ năm 2007 - 2012 với khoảng 1 - 8/14 địa phương có dịch.
Theo Phạm Chiến Thắng (2015), từ năm 2009 - 2014 trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa, bệnh LMLM ở trâu, bị có tỷ lưu hành cao nhất vào năm 2010 (0,327%) và thấp nhất vào năm 2012 (0,008%). Ở lợn cao nhất vào năm 2013 (0,049%) và thấp nhất vào năm 2009 (0,002%).
Nông Quang Hải (2015) nghiên cứu về bệnh LMLM ở trâu, bò tại tỉnh Bắc Kạn và cho biết: Dịch LMLM trên địa bàn tỉnh Bắc Kạn xảy ra quanh năm, nhưng số lượng gia súc mắc bệnh tập trung vào thời điểm cuối mùa Đông đến đầu mùa Xuân hàng năm, dao động từ 19,06 - 80,94%.
Lại Văn Lý (2015) đã nghiên cứu về bệnh LMLM tại tỉnh Quảng Ninh giai đoạn 2010 - 2015 và cho biết, dịch LMLM xảy ra liên tục trong 3 năm (1010 - 2012) và có diễn biến phức tạp, với 90 xã thuộc 8 huyện thành của tỉnh Quảng Ninh có dịch xảy ra. Từ 2013 - 2015, do cơng tác phịng chống dịch tốt nên không thấy dịch LMLM xảy ra tại các địa phương thuộc tỉnh Quảng Ninh.
Đàm Thị Phương Mai (2016) cho biết: Bệnh LMLM ở trâu, bò tại tỉnh Lạng Sơn đã xảy ra liên tục trên địa bàn của 11 huyện, thành phố trong giai đoạn từ 2011 - 2015, có 187 ổ dịch, bình qn mỗi địa điểm khảo sát có 3 - 4 ổ dịch/năm.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Virus gây bệnh lở mồm long móng ở một số loại gia súc móng guốc chẵn (trâu, bò, lợn nái).
- Trâu, bò, lợn nái đã và chưa được tiêm phòng vaccine Aftopor phòng bệnh LMLM.
2.1.2. Vật liệu và các thiết bị dùng trong nghiên cứu
2.1.2.1. Vật liệu dùng trong nghiên cứu * Kít xét nghiệm:
- ELISA Test KIT: FMD - 3ABC bo-ov mã FBT139T IDEXX Laboratory, In vitro diagnodicum, sản xuất tại Thụy Sĩ.
- LPB-ELISA: ELISA KIT for FMDV antibody detection (O, A, Asia1) mã R5109 do I.A.H. Pirbright Laboratory cung cấp.
- LPBE định type virrus LMLM sử dụng Kit FMD Antigen Detection Elisa Kit mã R5108 do I.A.H. Pirbright Laboratory cung cấp.
* Vaccine dùng trong thí nghiệm:
Thực hiện Chương trình Quốc gia khống chế bệnh LMLM giai đoạn I (2006 - 2011), giai đoạn II (2011 - 2015) của Bộ NN & PTNT. Theo kết quả nghiên cứu dịch tễ về bệnh LMLM của Cục Thú y, Quảng Ninh thuộc tỉnh nằm trong vùng khống chế bệnh LMLM, type lưu hành là type O. Do vậy, vaccine được sử dụng là vaccine đơn giá type O.
- Vaccine sử dụng: Vaccine Aftopor (là loại vaccine vô hoạt, thuần khiết nhũ dầu do Pháp sản xuất).
- Thành phần vaccine:
+ Kháng nguyên LMLM vô hoạt, type O (OManisa và O3039);
+ Mỗi liều chứa 15μg kháng nguyên 1465 cho mỗi chủng, đảm bảo ít nhất 3PD50 cho mỗi hiệu giá;
+ Chất bổ trợ: Nhũ dầu kép gồm: paraffin nhẹ, Sorbitan Mono Oleate, Mannnide Mono Oleate và Polysorleate;
+ Tá dược: dung dịch. - Sử dụng và liều dùng:
+ Tiêm sâu vào bắp thịt (lưu ý, trước khi dùng phải trộn đều vaccine, tránh tạo bọt khí);
+ Liều tiêm khơng kể tuổi và trọng lượng của gia súc (trâu bò tiêm 2ml/liều). - Bảo quản vaccine: Nhiệt độ bảo quản vaccine từ 2ºC đến 8ºC và phải được dùng ngay sau khi mở lọ.
2.1.2.2. Máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu
* Máy móc dùng trong nghiên cứu: tủ lạnh âm sâu, tủ lạnh thường, tủ sấy,
buồng cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, nồi đun cách thủy, cân phân tích, tủ ấm 37oC, máy li tâm lạnh, máy lắc đĩa, máy lắc trộn (vortex mixer), máy lọc nước, máy đo pH, máy đọc ELISA với kính lọc 492 nm, máy luân nhiệt PCR, máy rửa đĩa ELISA....
* Dụng cụ làm thí nghiệm:
- Các loại dụng cụ thông thường trong phịng thí nghiệm bao gồm: bình tam giác, ống đong thủy tinh, pipet thủy tinh, ống nghiệm các loại, hộp bảo quản và vận chuyển mẫu chuyên dụng, cân phân tích, micro pipet đơn kênh, micro pipep đa kênh, đầu típ nhựa các cỡ dùng cho micro pipet, bộ cối chày sứ, cát sạch để nghiền bệnh phẩm, khăn bông, dao, kéo, panh kẹp, đĩa nhựa polystyren 96 lỗ đáy chữ U.
- Hóa chất và các dung dịch cần thiết khác trong phịng thí nghiệm.
2.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1. Thời gian nghiên cứu: Từ 08/2019 đến 08/2020 2.2.1. Thời gian nghiên cứu: Từ 08/2019 đến 08/2020 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Địa bàn nghiên cứu: Các hộ gia đình ni trâu, bò, lợn tại một số huyện, thành thuộc tỉnh Quảng Ninh.
2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh lở mồm long móng ở trâu, bị, lợn tại tỉnh Quảng Ninh
2.3.1.1. Tình hình dịch LMLM ở trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh từ tháng 1/2018 đến tháng 6/2020.
2.3.1.2. Tỷ lệ trâu, bò, lợn mắc bệnh và chết do LMLM 2.3.1.3. Tỷ lệ trâu, bò, lợn mắc bệnh LMLM theo mùa.
2.3.1.4. Tỷ lệ trâu, bò, lợn chết do mắc bệnh LMLM theo mùa
2.3.2. Nghiên cứu sự tồn tại của kháng thể LMLM và xác định type virus gây bệnh LMLM ở trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh
2.3.2.1. Nghiên cứu sự tồn tại của kháng thể LMLM trên đàn trâu, bò, lợn sau tiêm phòng vaccine tại tỉnh Quảng Ninh.
2.3.2.2. Xác định type virus gây bệnh LMLM ở trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh
2.3.3. Lựa chọn và đánh giá tác dụng của vaccine phòng bệnh LMLM cho trâu, bò, lợn nái tại tỉnh Quảng Ninh.
2.3.3.1. Lựa chọn vaccine phòng bệnh LMLM cho trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh
2.3.3.2. Đánh giá tác dụng của vaccine phòng bệnh LMLM cho trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh
- Đánh giá kết quả tiêm phòng vaccine LMLM cho trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh từ tháng 1/2018 đến tháng 12/2019
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch của vaccine được lựa chọn tiêm phòng cho trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh
2.3.4. Đề xuất biện pháp phòng chống bệnh LMLM cho trâu, bò, lợn nái tại tỉnh Quảng Ninh
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh LMLM ở trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh
Đặc điểm dịch tễ của bệnh LMLM ở trâu, bò, lợn nái tại tỉnh Quảng Ninh được đánh giá trên cơ sở phương pháp điều tra dịch tễ học hồi cứu, dựa vào số liệu của Cục Thống kê, phịng Chăn ni, Chi cục Thú y tỉnh Quảng Ninh, bao gồm:
- Báo cáo tình hình chăn ni trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh.
- Báo cáo quý, báo cáo năm về tình hình dịch LMLM tại tỉnh Quảng Ninh. - Số liệu về dịch tễ bệnh LMLM, kết quả tiêm phòng hằng năm, kết quả xét nghiệm bệnh phẩm (định type), kết quả nghiên cứu, bảo hộ sau tiêm phịng.
* Tiêu chí đánh giá đặc điểm dịch tễ bệnh LMLM ở trâu, bò, lợn theo mùa được đánh giá qua 4 mùa: Xuân (từ tháng 2 đến tháng 4), Hè (từ tháng 5 đến tháng 7), Thu (từ tháng 8 đến tháng 10), Đông (từ tháng 11 đến tháng 1 năm tiếp theo).
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu sự lưu hành của virus LMLM trên đàn trâu, bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh bò, lợn tại tỉnh Quảng Ninh
2.4.2.1. Phương pháp lấy mẫu
* Phương pháp lấy mẫu huyết thanh:
- Cố định gia súc (bằng giá hoặc chạc cây tùy từng điều kiện thích hợp), sau đó garo tĩnh mạch cổ sao cho tĩnh mạch cổ nổi rõ.
- Dùng bơm tiêm loại 10 ml hút 3 ml máu tự tĩnh mạch cổ, sau đó rút pittong ra đến 5 ml, bẻ gập đầu kim và đậy lắp kim lại, để nghiêng cho máu đơng tự nhiên ở nhiệt độ phịng khoảng 2 giờ, sau đó chắt huyết thanh vào lọ thủy tinh hay lọ nhựa 2 ml vô trùng và gửi đến phịng thí nghiệm trong điều kiện lạnh (kèm các túi đá) càng sớm càng tốt.
- Bảo quản huyết thanh: Nếu huyết thanh được xét nghiệm ngay trong 7 ngày đầu tính từ lúc lấy mẫu thì bảo quản ở nhiệt độ 4oC, cịn nếu lâu hơn 7 ngày thì bảo quản ở nhiệt độ -30oC.
* Phương pháp lấy mẫu biểu mô:
- Kiểm tra lâm sàng và chọn gia súc mới phát bệnh, bệnh phẩm được lấy từ các tổn thương mới (không lấy mẫu từ các tổn thương ở giai đoạn lành sẹo hoặc đã được sát trùng và điều trị).
- Thu thập mẫu biểu mô ở những gia súc có triệu chứng của bệnh LMLM theo hướng dẫn của Cục Thú y và tuân thủ các quy tắc an toàn sinh học theo hướng dẫn của OIE để tiến hành xét nghiệm và định type virrus.
- Loại mẫu là biểu mơ lưỡi, lợi, kẽ móng chân, viền móng chân bị bong tróc do mụn nước mới vỡ ra, dịch trong mụn nước và da bao quanh mụn nước lúc chưa vỡ.
- Mẫu bệnh phẩm được bảo quản 4 - 8oC trong hỗn hợp PBS 0,04 M và Glycerin (tỷ lệ 1:1), pH = 7,2 - 7,6 trong suốt quá trình vận chuyển về phịng thí nghiệm.
- Bảo quản mẫu bệnh phẩm ở 4oC nếu xét nghiệm trong 1-3 ngày hoặc -80oC nếu chưa xét nghiệm ngay.
2.4.2.2. Phương pháp định type virus
Định type virus LMLM theo phương pháp RT-PCR được mô tả trong Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2010. Các bước cơ bản như sau:
Bước 1: Chiết tách ARN
Bước 2: Tiến hành phản ứng RT-PCR theo công thức Bước 3: Chu trình nhân gen
Bước 4: Chạy điện di Bước 5: Đọc kết quả Bước 6: Đánh giá kết quả
2.4.2.3. Phương pháp Liquid Phase Blocking ELISA (LPB-ELISA)
Phương pháp LPB-ELISA được tiến hành theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-1:2010.
* Mục đích thí nghiệm
- Xác định sự có mặt của kháng thể kháng virus LMLM type O trong huyết thanh trâu, bò sau khi tiêm phòng vaccine LMLM đơn giá type O.
- Theo yêu cầu của Cục Thú y, chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng virus LMLM trong huyết thanh trâu, bị được pha lỗng ở nồng độ 1/64.
* Nguyên liệu và các bước tiến hành phản ứng (xem trong phần Phụ lục) 2.4.3. Phương pháp đánh giá tác dụng của vaccine phòng bệnh LMLM cho trâu, bò, lợn nái tại tỉnh Quảng Ninh
Để xác định tác dụng của vaccine phịng bệnh LMLM chúng tơi đã đánh giá sự có mặt của kháng thể kháng virus LMLM type O bằng phương pháp ELISA FMD-3ABC.
2.4.4. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2010.
Tỷ lệ bảo hộ cá thể/tổng đàn được tính theo cơng thức:
Tỷ lệ bảo hộ (%) = Số mẫu đạt HGKT bảo hộ x 100 Tổng số mẫu kiểm tra
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH LMLM Ở TRÂU, BÒ, LỢN TẠI TỈNH QUẢNG NINH TỪ THÁNG 1/2018 ĐẾN THÁNG 6/2020
3.1.1. Diễn biến của tình hình dịch LMLM ở trâu, bò, lợn của tỉnh Quảng Ninh từ tháng 1/2018 đến tháng 6/2020
Tiến hành tổng hợp tình hình dịch lở mồm long móng tại Quảng Ninh từ tháng 1/2018 đến tháng 6/2020; thấy dịch LMLM xảy ra trên đàn gia súc (trâu, bò và lợn) vào cả 3 năm nghiên cứu. Diễn biến cụ thể ở các năm có dịch tại các địa phương thuộc tỉnh Quảng Ninh được thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tình hình dịch LMLM ở trâu, bị, lợn của tỉnh Quảng Ninh từ tháng 1/2018 đến tháng 6/2020 TT Địa phương (huyện, thành phố, thị xã) Số xã có dịch LMLM Tính chung theo địa phương 2018 2019 6/2020 Trâu, bò Lợn Trâu, bò Lợn Trâu, bò Lợn Trâu, bò Lợn 1 H. Ba Chẽ 1 2 3 2 H. Bình Liêu 4 1 2 6 1 3 H. Cô Tô 4 H. Đầm Hà 5 TX. Đông Triều 2 2 6 H. Hải Hà 7 H. Hoành Bồ 1 1 8 H. Tiên Yên 9 H. Vân Đồn 10 TX. Quảng Yên 11 TP. Cẩm Phả 12 TP. ng Bí 2 2 13 TP. Hạ Long 14 TP. Móng Cái Tổng số xã có dịch 0 2 5 4 4 0 9 6
Kết quả bảng 3.1 cho thấy: dịch LMLM ở trâu, bò, lợn xảy ra từ tháng 1/2018 đến tháng 6/2020 tại 5/14 địa phương của tỉnh Quảng Ninh, bao gồm: huyện Ba Chẽ, huyện Bình Liêu, thị xã Đơng Triều, huyện Hồnh Bồ và thành phố ng Bí.
* Tình hình dịch LMLM xảy ra trên các đối tượng gia súc như sau:
- Ở trâu, bò: dịch LMLM xảy ra ở trâu, bò tại tỉnh Quảng Ninh tập trung vào năm 2019 và nửa đầu năm 2020 tại 3 xã của huyện: Ba Chẽ và 6 xã của huyện Bình Liêu; các địa phương khác không ghi nhận trường hợp trâu, bò nào mắc bệnh LMLM trong cả 3 năm điều tra.
- Ở lợn: tại tỉnh Quảng Ninh, bệnh LMLM ở lợn xảy ra vào năm 2018 và 2019; trong nửa đầu năm 2020 khơng thấy có lợn mắc bệnh tại tất cả các huyện, thành của tỉnh. Năm 2018, bệnh LMLM ở lợn chỉ xảy ra tại 2 xã của thị xã Đông Triều; đến năm 2019, dịch LMLM lợn xảy ra tại 5 xã, phường thuộc 4 huyện thành của tỉnh Quảng Ninh là: huyện Bình Liêu (1 xã), thị xã Đông Triều (1 xã), huyện Hồnh Bồ (1 xã) và thành phố ng Bí (2 xã, phường).
* Tình hình mắc LMLM tại tỉnh Quảng Ninh theo năm như sau:
- Năm 2018: Dịch LMLM chỉ xảy ra trên đàn lợn tại thị xã Đông Triều, khơng ghi nhận trường hợp trâu, bị nào mắc bệnh LMLM trên phạm vi toàn tỉnh.