3.2 Quá trình phân lập các chất từ dịch chiết MeOH
3.2.1 Khảo sát thành phần định tính và lựa chọn dung môi
Triển khai sắc ký lớp mỏng
Pha hệ dung môi rồi đổ vào bình triển khai.
Đưa chất lên lớp mỏng bằng ống mao quản, cách đáy bản 1,5 cm và cách đều hai bên mép bản, sấy để dung môi bay hết rồi đưa vào bình triển khai.
Dung môi chạy từ dưới lên trên, chất có độ phân cực yếu hơn chạy lên trên, chất có độ phân cực cao hơn ở dưới.
Khi dung môi chạy lên cách mép trên của bản khoảng 0,3 cm thì lấy bản mỏng ra, sấy để dung môi bay hết.
Lập sắc ký đồ
Tiến hành lập sắc ký đồ trong các điều kiện sau: Quan sát dưới ánh sáng thường.
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254 nm và 366 nm.
Phun thuốc thử, sấy bản mỏng, quan sát dưới ánh sáng thường.
Mỗi vết tách ra trên bản mỏng có một giá trị Rf khác nhau. Khi phun thuốc thử giá trị Rf không thay đổi.
Dựa trên sắc ký đồ, phân tích sơ bộ thành phần chiết để biết: Số lượng chất có trong phần chiết.
Đánh giá sơ bộ khả năng phân tách chất của dung môi trên silicagel. Tiến hành
Lấy một ít cặn dịch cho vào ống nghiệm, đem hòa tan hoàn toàn trong CH2Cl2. Dịch thu được đem định tính bằng TLC với các hệ dung môi khai triển sau:
I: Diclomethan (100%)
II: Diclomethan-Methanol (9:1) III: n-hexan-Ethyl acetat (5:5)
IV: n-hexan-Ethyl acetat (4:6) V: n-hexan-Aceton (8:2) VI: n-hexan-Aceton (9:1)
Kết quả so sánh cho thấy các chất được khai triển tốt nhất ở hệ dung môi II được thể hiện ở bảng sau.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát cặn chiết MeOH bằng TLC đối với hệ dung môi II
STT Rf (cm) UV 254 nm 366 nm 1 0,97 (-) (-) 2 0,89 Vàng nâu Vàng 3 0,83 (-) Hq xanh tím 4 0,81 Vàng Hq xanh lục nhạt 5 0,79 Vàng nâu Vàng nâu 6 0,69 (-) Hq xanh tím 7 0,68 (-) Vàng 8 0,66 Vàng Vàng 9 0,59 Vàng Hq xanh lục 10 0,55 (-) (-) (-): không hiện
Do đó, lựa chọn hệ dung môi CH2Cl2-MeOH với độ phân cực tăng dần làm dung môi rửa giải cho cột tổng cặn MeOH của thân cây Trâu cổ.
3.2.2 Quá trình phân lập các chất
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cột
Cột có đường kính 10 cm, chiều dài 100 cm được rửa sạch, tráng cột bằng aceton, sấy khô, lót dưới đáy một ít bông.
Chuẩn bị cột silica gel theo phương pháp nhồi cột ướt: Lấy khoảng 300 g silica gel cỡ hạt 40-60 µm.
Ngâm trương nở trong CH2Cl2 khoảng 30 phút, trong quá trình ngâm dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục để đuổi hết bọt khí.
Rót từ từ dung dịch silica gel đã trương nở vào cột, vừa rót vừa gõ nhẹ, nén cột bằng áp suất để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định khoảng 1h.
Giai đoạn 2: Nhồi cột
186,6 g cặn chiết MeOH được hòa với MeOH vừa đủ cho tan hết, rồi đem trộn với khoảng 180 g silica gel, làm bay hơi hết dung môi đến khi thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu đen.
Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột.
Giai đoạn 3: Chạy cột
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2-MeOH gradient (0-100%). Hứng dịch rửa giải khoảng 60-80 ml vào mỗi bình nón.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các bình có các vết chất tương đương nhau trên bản mỏng.
Bảng 3.2. Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng MeOH
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lượng 1 1-7 600 ml CH2Cl2 F1 5,9 g 2 8-14 600 ml CH2Cl2-MeOH 99:1 F2 4,9 g 3 15-39 300 ml CH2Cl2-MeOH 99:1 1200 ml CH2Cl2-MeOH 98:2 F3 9,4 g 4 40-58 1200 ml CH2Cl2-MeOH 97:3 F4 4,5 g 5 59-78 1200 ml CH2Cl2-MeOH 96:4 F5 16,9 g 6 79-107 900 ml CH2Cl2-MeOH 95:5 900 ml CH2Cl2-MeOH 94:6 F6 5,5 g 7 108-127 1200 ml CH2Cl2-MeOH 93:7 F7 1,1 g 8 128-157 900 ml CH2Cl2-MeOH 92:8 900 ml CH2Cl2-MeOH 90:10 F8 1,4 g 9 158-hết 900 ml CH2Cl2-MeOH 85:15 600 ml CH2Cl2-MeOH 70:30 900 ml MeOH F9 68 g
Phân lập các hợp chất từ các phân đoạn F8
Phân đoạn F8 được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2-MeOH gradient (0-10%) thu được 3 phân đoạn nhỏ F8.1-F8.3. Phân đoạn F8.2 kết tinh trong hỗn hợp dung môi CH2Cl2-MeOH thu được 50 mg hợp chất dưới dạng bột màu trắng kí hiệu là M1. Quy trình phân lập cặn chiết MeOH được trình bày tóm tắt như trong sơ đồ sau:
Hình 3.7. Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH thân cây Trâu cổ
3.3 Xác định cấu trúc hợp chất M1
Sau khi tiến hành ngâm chiết mẫu cây Trâu cổ, sắc kí silica gel nhiều lần và kết tinh đã phân lập được hợp chất M1. Hợp chất được đo phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân tại Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Từ những dữ kiện phổ thu được và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu trúc của hợp chất M1 là một hỗn hợp -sitosterol-3-O--D- glucopyranoside và stigmasterol-3-O--D-glucopyranoside.
Cặn dịch MeOH 186,6 g CC (silica gel), CH2Cl2-MeOH gradient F5 16,9 g F6 5,9 g F7 1,2 g F8 1,4 g CC (silica gel), CH2Cl2-MeOH gradient Kết tinh (CH2Cl2 - MeOH 9:1) F8.1 F8.2 F8.3 F4 4,5 g F3 9,4 g F2 4,9 g F1 5,9 g M1 50 mg F9 68,0 g
Chất rắn màu trắng; đnc 259-261oC; Rf = 0,58 (CH2Cl2-MeOH 9:1); không hiện UV, hiện màu bằng TT Ceri sulfat có màu xanh tím.
FT-IR (KBr) νmax (cm-1): 3418; 2930; 2870; 1633; 1462; 1374; 1165; 1022; 886; 800; 620. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 5,31 (br s); 5,14 (dd, J=8,5; 15,0 Hz, H- 22); 5,02 (dd, J=8,5; 15,0 Hz, H-23); 4,42 (t, J=6,0 Hz); 4,21 (s, J=8,0 Hz); 3,63 dd, J=5,5; 10,5 Hz); 0,98 (d, J=6,5 Hz, CH3); 0,89 (d, J=6,5 Hz, CH3); 0,81 (s, CH3); 0,80 (s, CH3); 0,79 (s, CH3); 0,77 (d, J=6,5 Hz, CH3); 0,66 (s, CH3); 0,64 (s, CH3). EI-MS: m/z 396 [M-C6H12O6]+ Hình 3.8. Cấu trúc hợp chất M1
Chất M1 thu được dưới dạng chất rắn màu trắng có điểm chảy là 259-261oC. Phổ hồng ngoại FT-IR cho đỉnh hấp thụ mạnh ở 3418 cm-1 cho thấy sự có mặt của nhóm OH trong phân tử. Phổ 1H-NMR cho phép xác định sơ bộ đây là hỗn hợp của -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside và stigmasterol-3-O--D- glucopyranoside với sự có mặt của 7 nhóm methyl ở phía trường cao và 1 nhóm methin H-6 ở H 5,13; 2 proton H-22 và H-23 của stigmasterol dưới dạng doublet doublet ở H 5,14 (dd, J=8,5; 15,0 Hz, H-22) và 5,02 (dd, J=8,5; 15,0 Hz, H-23), cùng với tín hiệu của 1 đường glucose trong phân tử. So sánh trên sắc ký lớp mỏng TCL với hỗn hợp của -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside và stigmasterol-3-O- -D-glucopyranoside chuẩn ở phòng thí nghiệm (Rf=0,58, hệ dung môi: CH2Cl2-
1 2 3 5 7 9 8 11 10 12 14 13 15 16 17 h h 18 20 19 23 21 22 25 24 27 28 29 O H HO H HO H H OH H O OH 1 2 3 4 6 5 7 9 8 11 10 12 14 13 15 16 17 h h 18 20 19 23 21 22 25 24 26 27 28 29 O H HO H HO H H OH H O OH 26
MeOH 9:1, hiện màu bằng TT Ceri sulfat) và các dữ kiện phổ EI-MS, 1H-NMR cho phép nhận dạng M1 là hỗn hợp của -sitosterol-3-O--D-glucopyranoside và stigmasterol-3-O--D-glucopyranoside.
So sánh M1 và hỗn hợp -sitosterol-3-O--D- glucopyranosit và stigmasterol-3-O--D- glucopyranosit chuẩn trong phòng thí nghiệm (hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 9:1, hiện màu bằng TT CeSO4).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Kết quả của đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra:
- Thu được mẫu thân cây Trâu cổ (7,5kg tươi xử lý được 4,6 kg khô), điều chế các cặn dịch chiết n-hexane (FPSH 53,6g), CH2Cl2(FPSD 47,2g), EtOAc (FPSE 28,9g), MeOH (FPSM 186,6g) của thân cây Trâu cổ.
- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học hợp chất thiên nhiên -sitosterol-3-
O--D-glucopyranoside và stigmasterol-3-O--D-glucopyranoside (M1) từ
cặn MeOH thân cây Trâu cổ.
Cấu trúc của hợp chất M1 đã được xác định bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, phổ hồng ngoại và khổ khối lượng.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục tinh chế các phân đoạn còn lại của dịch chiết MeOH, các cặn chiết khác của thân cây Trâu cổ (Ficus pumila L.) nhằm tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có trong thân loài cây này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1, NXB Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội, tr.1155-1173.
[2]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[3]. Đặng Như Tại, Ngô Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ, Tập 1. NXB Giáo dục Việt Nam, tr.478-513.
Tài liệu Tiếng Anh
[4]. Anshul Chawla, Ramandeep Kaur, Anil Kumar Sharma. Ficus carica Linn. (2012): A Review on its Pharmacognostic, Phytochemical and Pharmacological Aspects. International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological
Research, 1(4): 215-232.
[5]. T.W.G. Solomons, C.B. Fryhle (2011), Organic chemistry-10th edition, John Wiley Sons, INC.
[6]. L.G. Wade (2010), Jr. Organic Chemistry-7th edition. Pearson Prentice Hall, pp.1210.
[7]. http://www.chem.ucalgary.ca/courses/351/Carey5th/Ch13/ch13-nmr-3b.html
[8]. http://www.fao.org/3/a-a0691e/A0691E05.htm
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
ThS. Nguyễn Thị Bình Yên
SINH VIÊN
PHỤ LỤC
Một số hình ảnh nghiên cứu ở phòng thí nghiệm