Tên mồi Trình tự (5’….3’) Độ dài
(nt)
Vị trí trên
hệ gen Chú thích
C6863H-F GTCGATCCGRCATTTAAACCTG 22 6863-6885 Mồi cho phản ứng PCR C7950H-F TGACACTRGCTTCCTTGTGTG 21 7950-7971 Mồi giải trình tự C8250H-R TTCCCATGAYGTTYGGTTGC 20 8230-8250 Mồi giải trình tự C9071H-R ATTTGGGCTATCTAGATGGACC 22 9049-9071 Mồi cho phản ứng
PCR
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Để thu nhận hệ gen virus chúng tôi tiến hành các thí nghiệm theo sơ đồ sau đây
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu
2.3.2.2. Phương pháp khảo sát triệu chứng lâm sàng
Lập sổ theo dõi, ghi đầy đủ thông tin: lứa tuổi, giới tính, giống, địa phương, tình trạng tiêm phòng vaccine… thông qua chủ nuôi
Chó nghi mắc bệnh sẽ được khảo sát đầy đủ thông tin về triệu chứng lâm sàng ở: mắt, mũi, nôn mửa, tiêu chảy, gan bàn chân, nốt sài, biểu hiện thần kinh… Sau đó dùng test để kiểm tra và xác định chó mắc bệnh.
* Biểu hiện của chó nghi mắc bệnh: Chó ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn hoặc
bỏ ăn. Con vật nôn ra bọt vàng, bọt trắng, thời gian nôn kéo dài. Chảy nước mũi, lâu dần sẽ thở gấp, thở khò khè. Tiêu chảy kéo dài, phân nhày, mùi tanh. Chó kiệt sức nhanh, co giật và chịu tác động trực tiếp vào hệ thần kinh. Mắt đục dần và có mủ, loét. Xuất hiện chấm đỏ ở bẹn và bụng dưới. Phân chuyển màu theo các giai đoạn bệnh cho tới khi ra máu tươi và chết.
Thu mẫu bệnh phẩm Tách chiết ARN tổng số Chuyển đổi cDNA Giải trình tự Tinh sạch sản phẩm PCR Tìm kiếm/so sánh/tìm cấu trúc gen Phân tích, xử lý chuỗi gen So sánh, đối chiếu, lập phả hệ Thực hiện phản ứng PCR
2.3.2.3. Phương pháp thu thập bệnh phẩm
Dùng tăm bông vô trùng lấy các mẫu bệnh phẩm (gỉ mắt, gỉ mũi, phân) thu nhận trên chó nghi mắc bệnh Care, sau đó cho vào túi nilon và buộc kín, có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết.
Dùng xilanh lấy máu tĩnh mạch, có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết. Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản lạnh và đem về phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học.
2.3.2.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Mẫu bệnh phẩm được hòa tan lại trong 200 µl nước vô trùng trước khi dùng để tách chiết RNA tổng số.
RNA tổng số của virus được tách chiết bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau: