Bước 1 Thêm dung dịch Binding Buffer vào ống có chứa sản phẩm PCR với tỉ lệ 1 : 1 (w/v). Đun nóng ở 65°C cho đến khi gel tan hết. Bước 2
Chuyển toàn bộ dung dịch thu được từ bước 1 vào cột tinh sạch GeneJET. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ phần dịch phía dưới ống hứng.
Bước 3 Bổ sung 700 µl dung dịch rửa Wash Buffer, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ dịch phía dưới ống hứng. Bước 4 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn
dung dịch rửa. Bước 5
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml sạch.
Bổ sung 50 µl dung dịch Eluted Buffer, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 6 Thu dịch DNA, bảo quản ở -200C
2.3.2.9. Phương pháp giải trình tự
Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa vào hoạt động của enzyme DNA-polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, emzym DNA-polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide không chứa nhóm 3’-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide.
Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao gồm: bung liên kết, mồi bám và enzyme Taq-polymerase cùng các điều kiện
thích hợp. Mồi sử dụng là mồi đơn dài khoảng 20 đến 24 nucleotide, thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP) và 1%
dideoxy NTP (ddNTP) tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng để làm cho phản ứng nối dài chuỗi đơn nucleotide dừng lại ngẫu nhiên). Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5’→ 3’ dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trình tự, phân tích tự động bằng máy với các chương trình phần mềm tin - sinh học.
Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo chiều 5’→3’. Mỗi một lần giải trình tự, chuỗi thô (chuỗi có thành phần DNA ban đầu chưa được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm đến vài nghìn nucleotide; thông thường là 500 - 1000 nucleotide nếu được giải trình trên máy giải trình trình tự tự động.
2.3.2.10. Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin - sinh học
Trình tự DNA thu nhận được từ máy giải trình tự, được cung cấp ở hai dạng: chuỗi nucleotide thô ở dạng chữ (.txt) và chuỗi nucleotide thô ở dạng giản đồ chromatogram (.ab1). Chuỗi ở dạng .txt cho phép nhận biết chuỗi giải trình tự có đạt yêu cầu không, còn chuỗi nucleotide ở dạng .ab1 cho phép đưa vào các chương trình chuyên biệt (ví dụ: Chromas, BioEdit, SeqEd) để phân tích, biên tập với mục đích xác định chính xác từng nucleotide để có chuỗi cuối cùng (chuỗi tinh hay chuỗi đã biên tập). Cuối cùng, chuỗi đã được biên tập (edition) được sử dụng ở dạng .txt, vì ở dạng này, tất cả các chương trình phân tích gen (ví dụ: MEGA, GeneDoc, MacVector) đều có thể nhận biết.
* Chương trình so sánh và phân tích chuỗi gen - GeneDoc
GeneDoc là một chương trình nổi (interface application) được lập trình cho máy tính PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở dạng .msf (multiple sequence file) (Nicholas KB và Nicholas HB, 1999), GeneDoc cho phép xác định trình tự amino acid của gen nhân và gen ty thể,
đưa ra cấu hình của các chuỗi đã được so sánh để chuyển nạp vào MEGA cho phân tích phả hệ. Trong nghiên cứu sử dụng chương trình GeneDoc 2.7.
* Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA)
MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) là một hệ chương trình nổi giao diện (interface application) được lập trình dễ sử dụng cho các nhà nghiên cứu di truyền học phân tử với mục đích so sánh đối chiếu các chuỗi gen đồng chức năng từ các chủng cùng loài, từ các chủng khác loài trong cùng giống/chi thuộc cùng một họ từ đó suy ra mối quan hệ nguồn gốc và phả hệ ở góc độ tiến hóa phân tử (Tamura và cs., 2013). Trong nghiên cứu sử dụng chương trình MEGA 7.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả về tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận trên địa bàn Hà Nội bàn Hà Nội
3.1.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận ở Hà Nội
Chúng tôi đã đến một số phòng khám trên địa bàn 3 quận Hà Đông, Cầu Giấy và Nam Từ Liêm - Hà Nội để thu thập thông tin về chó mắc bệnh Care được mang đến khám, điều trị và thu các mẫu bệnh phẩm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1: