Khi giọt lỏng nhỏ lên bề mắt rắn, tất cả chất rắn, lỏng, khí đều có khuynh hướng thu nhỏ diện tích tiếp xúc của các mặt phân giới, nhằm giảm năng lượng bề mặt rắn-lỏng, lỏng-khí, rắn-khí nhỏ nhất. Phương trình Young mô tả liên hệ giữa góc tiếp xúc và tương tác giữa 3 chất rắn-lỏng-khí:
γlgcosθ=γsg−γsl
Trong dó: γlv, γsv, γsl lần lượt là sức căng mặt ngoài của các bề mặt lỏng-khí, rắn – khí và rắn-lỏng, θ là góc tiếp. Khi bề mặt rắn được biến đổi hóa học, có thêm các nhóm chức trên bề mặt thì trang thái phân cực của bề mặt rắn thay đổi. Từ đó có thể làm thay đổi tính ái nước hoặc kỵ nước của bề mặt, tức là thay đổi góc tiếp xúc với nước. Ví dụ,
khi bề mặt vàng (Au) gắn kết các hợp chất cysteamine, glutaraldehyde, protein, … thì tính phân cực của các phần đuôi (nhóm chức tự do) sẽ quyết định góc tiếp xúc. Sau khi gắn cysteamine lên bề mặt Au, đầu SH sẽ quay vào bề mặt Au, còn đầu NH2 sẽ là đầu tự do quay ra ngoài và tương tác với nước khi đo góc tiếp xúc. Do trong nhóm NH2 thì N có độ âm điện mạnh và thu hút điện tử của 2 nguyên tử H về phía nó, nên nhóm này có tính phân cực, về phía N có nhiều điện tích âm hơn, còn 2 nguyên tử H có ít điện tích âm hơn. Do đó, NH2 có khuynh hưởng tương tác mạnh với nước cũng là phân tử phân cực, vì O có độ âm điện mạnh hút các điện tử của H. Khi đó góc tiếp xúc giữa bề mặt Au với nước sẽ giảm đi [25]. Đối với bề mặt Au sau khi gắn glutaraldehyde và protein, cũng xảy ra hiện tượng tương tự.
1.4.1.3. Phƣơng pháp phản ứng đổi màu nhờ enzim HRP
Một phương pháp nữa để đánh giá hiệu quả của quá trình biến đổi bề mặt là sử dụng phản ứng đổi màu nhờ enzim horseradish peroxidase (HRP) trong dung dịch O- dianisidine và H2O2. Phản ứng đổi màu của dung dịch chỉ xảy ra khi có mặt của enzim xúc tác là horseradish peroxidase. Như vậy, phản ứng càng mạnh khi làm lượng HRP được gắn lên GAD trên bề mặt càng lớn, chứng tỏ hiệu quả biến đổi bề mặt càng lớn.
Dung dịch phản ứng bao gồm một cặp chất oxy hoá – khử gồm o-dianisidine 1mM (đóng vai trò là chất khử) và H2O2 (là chất oxi hóa) 1mM trong đệm phosphate pH 7.4 được chuẩn bị trong cốc thuỷ tinh cả 2 chất này đều là trong suốt, không có màu trước khi thí nghiệm. O-dianisidine đóng vai trò là chất cho proton H+ và khử H2O2 thành 2 phân tử nước, phản ứng này đòi hỏi phải có sự xúc tác của enzim HRP. Sau phản ứng thì o-dianisidine cũng bị oxi hóa trở thành dạng oxi hóa, quá trình diễn ra theo sơ đồ sau:
Sau khi thực hiện xong phản ứng ELISA, những chip đã gắn được HRP sẽ tạo dung dịch có màu hồng do o-dianisidine mất 2 proton H+ để chuyển từ dạng khử sang dạng oxy hoá. Dung dich chuyển từ không màu sang màu hồng có khả năng hấp thụ bước sóng 540nm được đo bằng máy quang phổ.
1.4.2. Phƣơng pháp đo độ lệch thanh dao động để phát hiện chất đánh dấu sinh học
o-dianisidine (dạng khử, không màu) Peroxidase se o-dianisidine (dạng oxi hóa, nâu) H2O2 +
nguyên lý đo độ lệch của thanh dao động được như hình 1.4.6.