Các quá trình (1, 3, 4, 5, 6) được thực hiện tương tự như trong mục 2.1.2.1 ở trên.
2.1.2.3. Tối ƣu hóa quy trình xử lý plasma oxy
Đã tiến hành tối ưu quá trình xử lý plasma oxy để xác định các thông số tối ưu của quá trình xử lý bằng cách lần lượt thay đổi các thông số thời gian xử lý, lưu lượng khí oxy, công suất plasma ICP. Các quá trình còn lại được thực hiện như trong mục 2.1.2.2.
Kết quả thu được, được áp dụng vào quy trình biến đổi bề mặt SiNx.
2.1.2.4. Áp dụng quy trình plasma tối ƣu để biến đổi bề mặt SiNx với GOPTS
Thực hiện quy trình biến đổi bề mặt SiNx như trong sơ đồ mục 2.1.2.2 với các thông số tối ưu của quá trình xử lý plasma.
2.1.2.5. Thử nghiệm APTES+GAD
APTES + GAD thường được dùng trong quá trình silane bề mặt SiO2/SiNx nên đã tiến hành thử nghiệm biến đổi bề mặt với các chất này và so sánh kết quả với GOPTS. Sau khi xử lý bề mặt SiNx bằng quy trình plasma oxy tối ưu, đã tiến hành xử lý cho APTES và sau đó là GAD phản ứng với mẫu. Kết quả cho thấy sử dụng kết hợp APTES+GAD sẽ cố định đươc nhiều protein hơn là sử dụng GOPTS.
Hình 2.1.14: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD áp dụng các quy trình tối ưu hoá.
Kết quả thu được cho thấy hiệu quả biến đổi bề mặt SiNx của APTES+GAD tốt hơn GOPTS nên nó được sử dụng để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động nhằm dò tìm DKK1.
2.1.2.6. Ứng dụng thanh dao động động để dò tìm DKK1
Các thanh dao động trên chíp với mặt trên phủ Au, mặt dưới là SiNx, được xử lý nhờ quy trình plasma+APTES+GAD tối ưu để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động. Kết quả được đánh giá bằng việc đo độ lệch của các thanh dao động trước và sau khi gắn kháng nguyên.
Quy trình thực hiện được trình bày như trong sơ đồ hình 2.1.15 dưới đây:
Làm sạch mẫu
• Ngâm trong Acetone 5 phút ->ngâm trong ethanol 30s-> DI->N2 • Ngâm trong piranha 5 phút -> rửa lại bằng nước DI-> xịt khô N2.
Xử lý plasma
oxy
• Sau khi làm sạch, mẫu được mang đi xử lý plasma oxy với các thông số tối ưu: thời gian là 60 phút, lưu lượng khí oxy là 40 sccm, công suất plasma ICP là 300W.
Tạo nhóm silanol
• Ngâm mẫu trong dung dịch piranha, 5 phút để tạo nhóm silanol trên bề mặt. • Rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
Gắn APTES
• Ngâm mẫu trong dd APTES nồng độ 1%, thời gian 60 phút, to p. • Rửa bằng ethanol trong 15 phút, DI, N2.
Gắn GAD
• Ngâm mẫu trong dd GAD 2,5% trong đệm PBS pH7.4, thời gian 60 phút, to p. • Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2.
Gắn F- LCA
• Ngâm mẫu trong dd F-LCA 5ug/ml (pha loãng từ nồng độ 100ug/ml với PBS pH 7.4), 18h, 4oC.
• Rửa sạch bằng PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2.
Hình 2.1.15: Sơ đồ quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD nhằm thu nhận DKK1.
Trong quy trình này, vai trò của BSA cũng tương tự như trong mục 2.1.1.3. Cụ thể được mô tả như trong hình 2.1.16.
Làm
sạch chíp • Sau đó mang chíp đi xử lý plasma.
Tạo nhóm silanol bề mặt
• Xử lý plasma oxy với các thông số tối ưu. • Rửa lại chíp bằng nước DI, xịt khô N2.
Gắn APTES
• Ngâm chíp trong dd APTES 1%, trong 60 phút, to p.
• Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, rửa lại bằng nước DI, xịt khô bằng N2.
Gắn GAD
• Ngâm chíp trong dd GAD 2% trong đệm PBS pH 7.4, 60 phút, to p. • Rửa bằng đệm PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2. Gắn kháng thể anti- DKK1
• Ngâm chíp trong dd anti-DKK1 5ug/ml, 18h, 4oC . • Rửa lại bằng PBS pH 7.4, DI, N2.
Ngâm trong dd
BSA
• Ngậm chíp với dd BSA nồng độ 2%, 30 phút, to p.
• Rửa lại chíp trong PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2. • Đo độ lệch.
Gắn kháng nguyên
DKK1
• Ngâm chíp trong dung dịch DKK1 có nồng nồng độ khác nhau (đã pha với dd PBS pH 7.4), 2h, to
p.
• Rửa chíp trong PBS pH 7.4, 15 phút, DI, N2. • Đo độ lệch.
Hình 2.1.16: Vai trò của BSA trong trong quy trình APTES+GAD để biến đổi bề mặt
SiNx của thanh dao động.
2.2. Các phƣơng pháp và thiết bị khảo sát 2.2.1. F-LCA và kính hiển vi huỳnh quang
Ảnh huỳnh quang có được thông qua kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) sử dụng bước sóng kích thích 490nm, tại LNT. F-LCA phát xạ ánh sáng huỳnh quang mạnh nhất ở bước sóng 520 nm (màu xanh lục). Thiết bị BX41 tại LNT như hình 2.2.1: