3.4.1 Chuẩn bị chất chuẩn
Để chuẩn bị chất chuẩn, 5 ống propylen eppendorf 1,5 mL phải được đặt trên giá và đánh số.
Mỗi loại trong số này phải được thêm một chất pha loãng với lượng được xác định.
Dùng pipet tự động lấy nồng độ thích hợp của chất chuẩn gốc, thêm vào ống 5 và trộn bằng máy xoáy trong khoảng 10 giây.
Nồng độ thích hợp của tiêu chuẩn số 5 này phải được lấy bằng pipet tự động có đầu đã được thay đổi và đưa vào ống 4.
Quá trình này phải được lặp lại cho đến ống 1, sử dụng đầu pipet mới trong mỗi lần chuyển, và các chất chuẩn nên được chuẩn bị thông qua quá trình pha loãng nối tiếp.
3.4.2 Chuẩn bị dung dịch rửa
Để pha loãng 50 mL dung dịch rửa đậm đặc gấp 20 lần do công ty sản xuất cung cấp, nên cho 950 mL nước cất vào bình. Sau đó, thêm 50 mL dung dịch rửa đậm đặc 20 lần vào nước cất, bạn có thể có dung dịch rửa đậm đặc gấp 1 lần.
3.4.3 Các bước phân tích
- Cần bổ sung một lượng thích hợp đệm EIA vào các giếng NSB. - Cần thêm lượng thích hợp dung dịch tiêu chuẩn vào các giếng tiêu chuẩn; - Một lượng thích hợp của các giải pháp kiểm soát chất lượng liên quan phải được đặt trong các giếng đối chứng 1 (QC1) và QC2.
- Các giếng mẫu phải được bổ sung các chất pha loãng mẫu liên quan. - Tất cả các giếng trừ giếng mù phải được bổ sung một lượng kháng thể sơ cấp. - Đĩa phải được phủ bằng parafilm và để ủ ở nhiệt độ phòng trong một thời gian.
- Tất cả các giếng phải được rửa trong máy rửa ELISA sử dụng một lượng đệm rửa thích hợp.
- Mẫu được lắc bằng máy lắc quỹ đạo (350 vòng/phút) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
- Rửa trong máy rửa ELISA với đệm rửa như được hướng dẫn trên danh mục. - Cần thêm một lượng nhất định peptit được đánh dấu biotin vào tất cả các giếng, ngoại trừ mẫu trắng.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm và để ủ ở nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian được nêu trên danh mục.
- Cần gỡ bỏ lớp parafilm trên đĩa và làm sạch chất chứa trong giếng.
- Rửa lại trong máy rửa ELISA sử dụng dung dịch đệm rửa, sau đó sẽ được loại bỏ.
- Dung dịch SA-HRP nên được thêm vào tất cả các giếng.
- Đĩa phải được phủ bằng parafilm một lần nữa và để ủ trong máy lắc quỹ đạo (350 vòng/phút) ở nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định.
- Sau khi loại bỏ parafilm trên đĩa, tất cả các giếng phải được rửa trong máy rửa ELISA sử dụng một lượng đệm rửa thích hợp.
- Dung dịch TMB nên được thêm vào tất cả các giếng, sau đó sẽ được ủ. Ở giai đoạn này, đĩa nên được che để tránh ánh sáng.
- Đĩa sẽ được phủ parafilm một lần nữa và ủ.
- Cần loại bỏ parafilm và thêm axit (HCl 2N) vào từng giếng để dừng phản ứng. Sau khi thêm dung dịch dừng, màu xanh lam sẽ bắt đầu chuyển sang màu vàng.
Ngay sau khi thêm dung dịch dừng, phải đọc kết quả trong vòng 10 phút ở bước sóng 450 nm. Trước khi đọc, nồng độ của các chất chuẩn phải được nhập vào máy đọc ELISA. Do đó, thiết bị có thể vẽ đồ thị đường cong tiêu chuẩn và tự động tính toán nồng độ của các mẫu. Tính toán này có thể được in ra.
Trong phòng thí nghiệm của chúng tôi, một thiết bị ELISA ELX800 được sử dụng để đọc Bộ đọc, máy in và vòng đệm được sử dụng trong phương pháp ELISA được trình bày trong hình 3.7.
Hình 3.7 Máy rửa (a), đầu đọc kết quả (b) và máy in (c) được sử dụng trong quy trình ELISA