2008)
4.3.1 Thời gian xung (thời gian chuyển đổi, khoảng thời gian chuyển đổi)
Thời gian xung là khoảng thời gian chuyển hướng của trường. Các thí nghiệm đầu tiên về phân đoạn ADN trong điện trường xung cho thấy thời gian xung là thông số quan trọng nhất để phân tách phân tử.
Kích thước của các phân tử phân đoạn càng lớn thì việc chuyển đổi điện trường càng ít.
Với một thời gian xung nhất định, chỉ các phân tử thuộc một loại kích thước cụ thể mới xuất hiện trong điều kiện tối ưu để tách và có thể được phân đoạn một cách hiệu quả. Do đó, để phân đoạn DNA trong một phạm vi kích thước rộng, cần phải tìm ra chế độ tăng tuần tự của thời gian xung.
Hình 4.3 Ví dụ về phân đoạn và xác định kích thước của DNA nhiễm sắc thể bằng điện di trên gel trường xung với đoạn dốc thời gian xung
Sự thay đổi của thời gian xung trong quá trình điện di được gọi là “tăng dần”. Tham số này có thể được tăng lên trong suốt quá trình chạy liên tục hoặc không liên tục trên một phạm vi giá trị rời rạc. Sự gia tăng liên tục của thời gian xung từ nhỏ nhất đến lớn nhất của các giá trị xác định trong một khoảng thời gian nhất định được gọi là "nội suy". Một biến thể thay thế, thời gian xung tăng lên từng bước, được gọi là "bước".
Sự phân giải phân tử trong gel được đặc trưng bởi khoảng cách dải và độ sắc nét của dải. Vùng trong gel nơi đạt được hiệu quả phân tách DNA được gọi là “vùng phân giải” hay “cửa sổ phân giải”. Sự phụ thuộc giữa tốc độ di chuyển DNA và kích thước phân tử là tuyến tính trong vùng phân giải; do đó, có thể ước tính chính xác kích thước của các phân tử DNA trong vùng này.
4.3.2 Cường độ trường
Độ phân giải là hàm của cả thời gian xung và cường độ điện trường. Nhìn chung, cường độ trường càng cao thì tốc độ di chuyển phân tử càng cao. Tuy nhiên, kích thước phân tử càng cao thì sự phụ thuộc này càng lệch khỏi hàm tuyến tính.
Để tách các phân tử nhỏ hơn 1 Mb, cường độ trường áp dụng là 6 –10 V/cm. Cường độ trường càng thấp, độ phân giải càng cao; tuy nhiên, phạm vi kích thước của các phân tử được phân tách hẹp hơn.
Cường độ trường cao quá mức (cao hơn 10 V/cm) dẫn đến sự phân tách phân tử yếu và xuất hiện cái gọi là “vết bẩn”, tức là các vùng nhuộm DNA đồng nhất với các dải đơn không xác định bằng mắt thường.
Đối với các phân tử lớn (hơn 1 Mb), cường độ trường cao dẫn đến “hiệu ứng bẫy”, tức là sự cố định phân tử vĩnh viễn tự phát trong gel do những thay đổi cụ thể không thể đảo ngược của cấu trúc của chúng. Các phân tử như vậy được ưu tiên phân đoạn ở cường độ trường thấp (1–3 V/cm).
Thời gian xung và cường độ trường là các yếu tố có liên quan lẫn nhau. Độ phân giải PFGE được xác định bằng “hàm Window” sau:
W = E1,4 × Tp
Trong đó E là cường độ điện trường và Tp là thời gian xung.
Giá trị của hàm càng cao, kích thước của các phân tử DNA càng lớn để có thể phân tách hiệu quả. Rõ ràng là có thể đạt được sự phân tách các phân tử DNA có cùng dải kích thước với thời gian xung khác nhau nếu cường độ trường được thay đổi sao cho giá trị hàm W không đổi.
4.3.3 Định hướng lại góc
Tham số này trong một số thiết bị PFGE là cố định. Ở những thiết bị khác, nó thay đổi từ 90 đến 180°. Người ta chứng minh rằng sự thay đổi của góc định hướng lại không ảnh hưởng đáng kể đến sự di chuyển của các phân tử nhỏ hơn 1 Mb. Độ linh động của các phân tử lớn hơn tăng khi góc giảm; tuy nhiên, độ phân giải dải trong gel ngày càng giảm. Theo kinh nghiệm, người ta thấy rằng sự phân tách tốt nhất đạt được với giá trị góc hơn 110°. Hầu hết các dụng cụ thương mại có sẵn cho PFGE sử dụng một góc cố định 120°.
4.3.4 Nồng độ agarose trong gel
Nồng độ agarose trong gel ít ảnh hưởng đến tính di động của các phân tử DNA trong quá trình điện di trong trường xung hơn là trong trường không đổi.
Người ta thấy rằng độ phân giải có phần tốt hơn đối với gel agarose 1,2% so với gel 0,9%. Việc tăng thêm nồng độ agarose chỉ làm giảm tính linh động và do đó làm
tăng thời gian chạy mà không cải thiện độ phân giải. Trong thực tế, để tách các phân tử có kích thước nhỏ hơn 3 Mb, gel agarose 1,0–1,5% thường được sử dụng.
4.3.5 Thành phần và nhiệt độ của đệm điện di
Bộ đệm có độ bền ion cao, Tris-borate (0,5 × TBE) hoặc Tris-acetate (1 × TAE) thường được sử dụng cho PFGE.
Tính linh động điện di của các phân tử DNA trong trường xung phụ thuộc mạnh mẽ vào nhiệt độ đệm. Nhiệt độ càng cao, tốc độ di chuyển phân tử càng cao.
PFGE thường được thực hiện ở 12–16°C. Ở nhiệt độ đệm cao hơn, các dải trở nên rộng và khuếch tán. Nó làm giảm đáng kể độ phân giải và sự xuất hiện của vết bẩn.
4.4 Ưu và nhược điểm của phương pháp (Olive D. M., 1999)4.4.1 Ưu điểm 4.4.1 Ưu điểm
PFGE đã được chứng minh là vượt trội so với hầu hết các phương pháp khác để phân tích sinh hóa và phân tử. Nó có tính phân biệt cao và ưu việt hơn hầu hết các phương pháp phân tích Escherichia coli, enterococci kháng vancomycin, S. aureus,
loài Acinetobacter, Pseudomonas aeruginosa M. aviumvà .
PFGE hiệu quả hơn trong việc phân biệt các chủng S. aureus kháng methicillin so với các phương pháp khác được thử nghiệm.
PFGE cũng có tính phân biệt cao hơn so với PCR dựa trên trình tự yếu tố lặp lại (Rep-PCR) để phân biệt các chủng của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii phức hợp, cầu khuẩn ruột kháng vancomycin, Neisseria gonorrhoeae và P. aeruginosa.
4.4.2 Nhược điểm
Một trong những yếu tố đã hạn chế việc sử dụng PFGE là thời gian hoàn thành phân tích. Mặc dù các bước thủ tục đơn giản nhưng thời gian cần thiết để hoàn thành thủ tục có thể từ 2 đến 3 ngày. Điều này có thể làm giảm khả năng phân tích số lượng lớn mẫu của phòng thí nghiệm.
CHƯƠNG 5: SẮC KÝ KHÍ 5.1 Nguyên tắc của sắc ký khí (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)
Cơ sở của sự phân tách là sự chậm lại của các thành phần riêng lẻ khi chúng được di chuyển qua một cột dài bởi khí mang, thường là heli hoặc nitơ.
Cột bao gồm một ống thép hoặc thủy tinh chứa đầy vật liệu đóng gói trơ như thủy tinh hoặc hạt gốm.
Hình 5.1 Sơ đồ của hệ thống sắc ký khí
Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), chúng được phủ một lớp chất lỏng dễ bay hơi, do đó diện tích bề mặt của chất lỏng tiếp xúc với khí là lớn.
Đối với một số ứng dụng, bao bì có thể là chất rắn mà không có bất kỳ lớp phủ chất lỏng nào được gọi là sắc ký khí-rắn (GSC), nhưng phương pháp này ít được sử dụng rộng rãi hơn GLC.
Mẫu được bơm vào dòng khí mang. Khi nó di chuyển qua cột với khí mang, các phân tử của mỗi chất có trong mẫu sẽ phân bố giữa chất khí và chất lỏng. Các phân tử riêng lẻ sẽ liên tục chuyển động giữa chất khí và chất lỏng ở trạng thái cân bằng động. Khi một phân tử ở trong pha khí, nó sẽ đi dọc theo cột, trong khi vẫn hòa tan trong chất lỏng, nó sẽ đứng yên. Một chất càng dễ bay hơi, thì tỷ lệ thời gian các phân tử của nó chuyển động trong khí mang càng lớn, và do đó, nó sẽ ra khỏi cột càng sớm. Bằng cách này, mỗi chất sẽ tách ra trong cột và tách ra theo thời gian ở cuối.
Thời gian từ khi tiêm đến khi peak hiện lên được gọi là thời gian lưu (Rt), và đặc trưng cho từng chất trong bất kỳ tập hợp điều kiện nhất định nào. Nó phụ thuộc vào độ bay hơi của chất, cũng như nhiệt độ của cột và chiều dài và đường kính của nó. Nhiều chất có thời gian lưu giữ lâu ở nhiệt độ phòng một cách bất tiện và điều này được khắc phục bằng cách nung cột trong lò.
Sau khi tách các thành phần trong cột để chúng nổi lên riêng lẻ, cần có một số phương pháp phát hiện và đo lường chúng. Hai loại detector thường được sử dụng: dẫn nhiệt và ion hóa ngọn lửa.
Máy dò độ dẫn nhiệt (TCD) dựa trên sự thay đổi độ dẫn nhiệt của khí rời khỏi cột. Khí mang helium tinh khiết đi qua một dây tóc vonfram-helium nóng, làm cho nó nguội đi, vì heli có độ dẫn nhiệt rất cao. Khi một chất hóa học xuất hiện cùng với khí
mang, quá trình làm mát sẽ ít hơn và nhiệt độ của dây tóc sẽ tăng lên. Như với hầu hết các kim loại, điện trở của nó tăng theo nhiệt độ và điều này có thể được đo và ghi lại.
Phát hiện ion hóa ngọn lửa (FID) thường gặp hơn trong các ứng dụng thực phẩm, vì nhiều hợp chất đang được khảo sát là hữu cơ (có chứa cacbon) và FID nhạy hơn khoảng một nghìn lần so với phát hiện độ dẫn nhiệt đối với các chất hữu cơ. Khí thoát ra khỏi cột được đốt cháy với hỗn hợp hydro và không khí. Điều này tạo thành các ion, dẫn một dòng điện có thể được khuếch đại và ghi lại trên một máy ghi biểu đồ. Mặc dù số lượng ion được tạo thành theo cách này là nhỏ, có lẽ chỉ bằng 0,0001% tổng số nguyên tử cacbon có trong mẫu, tỷ lệ được tạo ra luôn không đổi. Điều này có nghĩa là tổng tín hiệu được ghi trên bộ ghi biểu đồ tỷ lệ với lượng hóa chất hiện diện.
5.2 Chọn điều kiện chạy sắc ký (Al-Bukhaiti W. Q., 2017)5.2.1 Cột 5.2.1 Cột
Tất nhiên, cột là phần khởi đầu và trung tâm của một máy sắc ký. Cột được lựa chọn thích hợp có thể tạo ra sự phân tách sắc ký tốt để cung cấp phân tích chính xác và đáng tin cậy.
Cột được sử dụng không đúng cách thường có thể tạo ra sự phân tách khó hiểu, không đầy đủ và kém, có thể dẫn đến kết quả không hợp lệ hoặc phức tạp để diễn giải. Có hơn 10, 000 hợp chất có thể được phân tích bằng GC và hơn 400 cột mao quản GC. Các lựa chọn ban đầu của cột và thiết bị hỗ trợ có ảnh hưởng sâu sắc đến khả năng và kết quả cuối cùng của việc tối ưu hóa phân tách. Thao tác các thông số của cột (pha tĩnh, đường kính trong, chiều dài và độ dày màng) cho phép máy sắc ký kiểm soát hiệu quả của cột, độ phân giải và tốc độ phân tích.
Trong sắc ký khí, thứ tự rửa giải của chất phân tích bị chi phối bởi một số yếu tố như áp suất hơi tiềm ẩn, khả năng hòa tan trong pha tĩnh và xu hướng tương tác phân tử trong pha tĩnh. Tất cả các hiệu ứng này thay đổi theo nhiệt độ và hiệu ứng phối hợp của chúng cuối cùng xác định sự phân bố cân bằng của các phân tử chất tan giữa pha động và pha tĩnh.
5.2.2 Lựa chọn khí mang
Việc xác định vận tốc tuyến tính trung bình tốt nhất khá dễ dàng và chỉ liên quan đến một lượng nhỏ thử và sai.
Helium cung cấp độ phân giải tương tự, nhưng ở thời gian phân tích lâu hơn. Khi sử dụng heli làm khí mang, hãy thử vận tốc tuyến tính trung bình ban đầu là 30 cm/giây.
Nitơ không được khuyến khích sử dụng với cột mao quản do thời gian phân tích quá dài.
Việc lựa chọn khí được sử dụng làm pha động trong sắc ký khí chịu ảnh hưởng của các yêu cầu và cân nhắc sau: Trơ, Khô, oxy tự do, an toàn, chi phí và tính sẵn có.
5.2.3 Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ lò cột
Cột được đặt trong tủ sấy và nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình tách sắc ký, là một yếu tố cực kỳ quan trọng được sử dụng để kiểm soát GC.
Trong nhiều trường hợp, đẳng nhiệt không phải là chế độ nhiệt độ hiệu quả nhất để tách mẫu; trong những trường hợp như vậy, chương trình nhiệt độ có thể được sử dụng. Hầu hết các chương trình nhiệt độ GC có nhiệt độ ban đầu, một đoạn đường nối (độ tăng mỗi phút) và nhiệt độ cuối cùng.
Sử dụng chương trình nhiệt độ tuyến tính làm điểm bắt đầu nếu thông tin phân tích trước đó không có sẵn để sử dụng làm hướng dẫn, bước phát triển chương trình đầu tiên là thử một chương trình nhiệt độ tuyến tính, đơn giản.
Để cải thiện độ phân giải của các pic rửa giải sớm hơn, hãy giảm nhiệt độ ban đầu hoặc tăng thời gian giữ ban đầu. Giảm nhiệt độ ban đầu thường dẫn đến cải thiện độ phân giải lớn nhất, nhưng về cơ bản thời gian phân tích sẽ tăng lên. Độ phân giải của các peak rửa giải ở giữa sắc ký đồ có thể bị thay đổi bởi sự thay đổi tốc độ dốc. Nếu có độ phân giải đỉnh quá mức, tốc độ đường nối có thể được tăng lên để giảm độ phân giải và thời gian phân tích. Nếu không đủ độ phân giải, giảm tốc độ đường nối, nhưng tăng thời gian phân tích. Độ phân giải tốt hơn của các đỉnh rửa giải sau này thường xảy ra khi giảm tốc độ dốc.
5.2.4 Tối ưu hóa loại đầu tiêm, nhiệt độ và thể tích tiêm
Đưa mẫu vào hệ thống GC là một bước quan trọng trong quá trình phân tách. Độ tái lập của lượng mẫu được bơm vào là rất quan trọng để đảm bảo độ tái lập của kết quả.
Mẫu có thể được bơm thủ công vào hệ thống hoặc bằng cách sử dụng hệ thống lấy mẫu tự động. Một lỗi lớn trong GC là kỹ thuật tiêm kém.
Nhiệt độ kim phun để tách. Nhiệt độ của kim phun được sử dụng để hóa hơi nhanh chóng mẫu lỏng thành pha khí có thể đưa sang cột để tách.
Trong sắc ký khí mao quản và vi đóng gói (GC), có bốn kỹ thuật cơ bản để làm bay hơi một mẫu và chuyển nó vào đầu vào của cột phân tích: tiêm tách, không tách, trực tiếp và trên cột. Trong phương pháp này, tiêm tách và tiêm không tách lớp là những kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất.
Tiêm tách được chọn để phân tích mẫu có nồng độ cao. Trong chế độ tiêm phân chia, chỉ một phần nhỏ của mẫu hóa hơi được chuyển lên đầu cột. Phần còn lại của mẫu hóa hơi được đưa ra khỏi cổng tiêm qua đường thông hơi phân chia. Chỉ nên sử dụng cách tiêm phân chia khi nồng độ mẫu đủ cao để có thể loại bỏ một phần mẫu trong quá trình tiêm, trong khi vẫn duy trì đủ nồng độ chất phân tích tại máy dò để tạo ra dấu hiệu.
5.2.5 Lựa chọn pha tĩnh
Khi chọn cột, trước tiên hãy xác định đặc tính của mẫu để phù hợp với pha tĩnh của cột.
Pha tĩnh nói chung được chia thành 3 loại: thứ nhất không phân cực, thứ hai ở giữa cực và thứ ba có cực.
Pha tĩnh được phân loại thêm bằng Siloxan (không phân cực và trung cực) và Polyethylene glycol (PEG hoặc phân cực).
G1, G2 và G38 (100% Methyl Polysiloxan) không trải qua tương tác liên kết hydro. Sự thay đổi thứ tự rửa giải của Hexanol và Phenol với G14, G15, G16, G20, G39 và G47 (Polyetylen glycol) là sự kết hợp của tương tác liên kết lưỡng cực và liên kết hydro.
5.2.6 Tối ưu hóa đầu dò và nhiệt độ đầu dò
Nhiều loại đầu dò được bán trên thị trường để sử dụng với GC, mỗi loại có những hạn chế và ưu điểm riêng.
Đầu dò được sử dụng phổ biến nhất trong GC là đầu dò ion hóa ngọn lửa. Nhiệt độ của đầu dò và tốc độ dòng chảy tương đối của khí mang, hydro và không khí vào đầu dò là các thông số vận hành chính.
Một loạt các tiêu chuẩn được xác định để đánh giá các thông số của máy dò như độ trôi, độ ồn, độ nhạy, dải tuyến tính, dải động ... Sự thay đổi trong phản ứng của đầu dò với tốc độ dòng phụ thuộc vào việc đầu dò phụ thuộc vào nồng độ hay khối lượng.
Đối với các bộ tách sóng phụ thuộc nồng độ (ví dụ, bộ phát hiện độ dẫn nhiệt, bộ