(Trục tung là thời gian, trục hòanh là số lượng tế bào; đường cong biểu diễn các giai đọan tăng trưởng: pha lag, log, pha ổn định và pha chết. Tại thời điểm sớm của pha ổn định số lượng tế
bào đạt 108 – 1010 tế bào sống/ml)
Các giai đọan của các phương pháp bảo quản là thuần hóa, đặc trưng hóa, chuẩn bị
ampoule, đánh dấu, khử trùng, nuôi cấy các vi khuẩn trong môi trường duy trì (pha ổn
định sớm 108 - 1010 tế bào sống/ml), làm thành trạng thái lơ lửng của dịch nuôi cấy và sinh khối, chuyển vào các ampoule (0.1 – 0.5 ml), bảo quản giống gốc và lấy một sốđể
kiểm tra, ghi nhận các giống và đặc trưng hóa các giống gốc về khả năng sống, đặc trưng di truyền. Cần thiết duy trì tính sống của tế bào qua một thời gian, tính ổn định protein (từ
lạnh đông), bảo vệ tế bào trong môi trường khô và khả năng phục hồi của nó.
Vào ngày cuối cùng của khóa học, sau khi nghe giảng, chúng tôi thu thập các kết quả, thảo luận về kết quả thử nghiệm các chế phẩm trên cây thông qua hệ thống nuôi Leonard và túi sinh trưởng. Chúng tôi cũng thực hành với cách tính tóan MPN.
Time (h) Lag Log Stationary Death Nu m be r o f c
ell Early stationary phase
108 - 1010 viable cells/ml cells/ml
55
4. Các bài học từ khóa đào tạo
Mục tiêu của sản xuất chế phẩm vi sinh cốđịnh đạm rhizobium tại Việt nam là sản phẩm phải có chất lượng cao và có giá thành hợp lý. Do đó các công nghệ sản xuất cần phải đáp
ứng các đòi hỏi này. Sản xuất chế phẩm cốđịnh đạm phụ thuộc vào công suất các nồi lên men. Sử dụng các nồi lên men có dung tích lớn có một số trở ngại liên quan đến giá thành cao và thực hành sản xuất. Các fermentor lớn rất đắt tiền và chi phí đầu tư ban đầu cao.
Để vận hành các fermentor này cũng đòi hỏi con người có kỹ năng cao. Hơn nữa nếu một mẻ của fermentor bị tạp nhiễm điều này có nghĩa là tất cả mẻ sản xuất đó bị hỏng. Trong khóa đào tạo này chúng tôi đã thực hành với fermentor dung lượng 250 lít và nhân sinh khối chủng Bradyrhizobium (cho đậu tương) nhưng chỉ sau 3 ngày lên men trong fermentor này, mẻ cấy 100 lít môi trường đã phải đổ bỏ do bị nhiễm nặng. Sau đó nguồn nhiễm đã được xác định là từ vị trí cấy giống. Nó đã không được khử trùng tốt và không
được bao thật kín trong quá trình lên men. Một số trở ngại của các fermentor lớn trong sản xuất chế phẩm, đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển, đã dẫn đến khảo sát khả
Thảo luận về thử nghiệm chế phẩm cho lạc trong các bình Leonard
Kiểm tra nốt sần trong các túi sinh trưởng
Thực tập ghi nhận các kết quả Giải thích sự hình thành nốt sần
56
năng sử dụng pha lõang dịch nuôi cấy. Phương pháp pha lõang mà ởđó nước khử trùng
được dùng để pha lõang với một lượng nhỏ dịch sinh khối rhizobium (tới 1: 1000) có thể
có lợi về kinh tế trong các hệ thống sản xuất chế phẩm. Hơn nữa kỹ thuật này giảm số
lượng của các fermentor nuôi cấy rhizobia. Tuy nhiên để đáp ứng sản phẩm chất lượng cao thì một số yếu tố cần được xem xét và thử nghiệm trong điều kiện địa phương. Tầm quan trọng của kỹ thuật pha lõang dịch sinh khối nằm ở chỗ tế bào rhizobia phải nhân lên và tồn tại với số lượng cao trong các túi than bùn đã khử trùng. Khử trùng than bùn do đó cần phải được xem xét bởi vì nếu các vi sinh vật tạp nhiễm vẫn còn tồn tại trong than bùn với số lượng cao thì chúng sẽ nhanh chóng phát triển và cản trở phát triển của các rhizobia. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự khử trùng là ẩm độ tương đối của than bùn, nhiệt độ và thời gian khử trùng. Các chất dinh dưỡng thêm vào than bùn có vẻ không là yếu tốảnh hưởng đối với kỹ thuật pha lõang này. Nghiên cứu của P. Somasegaran (1985) chỉ rằng nước khử trùng dùng cho việc pha lõang dịch sinh khối và 3 dịch dinh dưỡng dùng pha lõang thì không khác nhau về số lượng tế bào được nhân lên và sự tồn tại của nó đối với các chủng thí nghiệm R. phaseoli TAL 182 và B. japonicum TAL 102. Tuy nhiên, có sự suy đóan rộng rãi về khả năng các chất dinh dưỡng được phóng thích ra từ
than bùn trong quá trình khử trùng và cơ chế chiết rút các chất dinh dưỡng bởi rhizobia từ
than bùn trong quá trình sinh trưởng và tồn tại chưa được khảo sát. Kỹ thuật pha lõang giống như kỹ thuật sản xuất dựa trên nền chất mang than bùn đòi hỏi nguồn than bùn xác
định và đã được đóng gói và khử trùng trong các túi plastic. Rất hữu dụng cho việc lựa chọn nguồn than bùn thích hợp phục vụ cho sản xuất chế phẩm chất lượng cao tại Việt nam bởi vì than bùn thì sẵn có tại Việt nam nhưng than bùn được phân bốđịa lý trải dài
đất nước do đó chất lượng than bùn sẽ rất khác biệt. MPU (đơn vị sản xuất chế phẩm dựa trên kỹ thuật pha lõang dịch sinh khối) phụ thuộc vào bơm pha lõang và tiêm dịch pha lõang vào than bùn. Dịch sinh khối qua bơm này được pha lõang, điều chỉnh thể tích và bơm vào than bùn. Thiết bị này đòi hỏi rất chính xác (để pha lõang một lượng rất nhỏ
dịch sinh khối với lượng rất lớn nước) và do đó đắt tiền. Có thể trộn lẫn trong điều kiện vô trùng nước khử trùng và dịch nuôi cấy với nhau trước khi nhiễm vào trong than bùn? Có thể thay thế nước khử trùng thông qua hệ thống khử trùng nước bằng tia UV trong hệ
thống bằng nước uống thương mại? Một đòi hỏi khác của kỹ thuật sản xuất chế phẩm dựa vào pha lõang sinh khối là điều kiện vô trùng cần phải duy trì trong quá trình sản xuất. Nơi sản xuất cần được sắp xếp hợp lý, ví dụ, cần có một nơi cho việc tiêm dịch vào túi than bùn và vị trí này nhất thiết phải rất vô trùng. Cuối cùng, trong hệ thống MPU dịch sinh khối nhiễm vào các túi than bùn từng cái một, điều này dường như không kinh tế lắm một khi trộn lẫn số lượng lớn túi than bùn và dịch sinh khối. Có thể có thiết bị trợ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
giúp trộn lẫn được thiết kế cho công đọan này? Hoặc là túi đựng chế phẩm lớn hơn cho việc trộn bằng tay dễ dàng hơn?
57
Sản xuất chế phẩm vi sinh cốđịnh đạm tại Việt nam hiện nay dùng than bùn. Do đó, có thể sẽ hợp lý nếu phát triển các kỹ thuật mà có sử dụng than bùn như là chất mang, như là kỹ thuật pha lõang (MPU) nói trên. Tuy nhiên các kỹ thuật khác cũng cần xem xét để làm sao cách sử dụng chế phẩm được dễ dàng hơn và giải quyết các trở ngại liên quan đến chất mang than bùn. Chế phẩm dạng dịch thể thì có lợi cho việc gieo hạt bằng máy. Áp dụng máy nông nghiệp cho sản xuất đang được chính phủ Việt nam khuyến khích, đặc biệt cho Miền Nam nơi cánh đồng canh tác của nông dân lớn hơn so với các vùng ở Miền Bắc. Các công thức chế phẩm dịch thể sử dụng các tác nhân thêm vào khác nhau mà nó có thể kích thích sự tồn tại của tế bào trong túi sản phẩm và sau khi bao vào hạt hay gieo vào đất. Các chất thêm vào này có thể cải thiện chất lượng chế phẩm như là dính tốt hơn vào hạt, ổn định sản phẩm, hạn chế các độc tố của hạt và tăng cường sự tồn tại của rhizobia trong quá trình bảo quản và sau khi tiếp xúc với môi trường đất. Sự tăng trưởng và tồn tại của các giống rhizobia trên polymer như polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol, gum arabic, sodium alginate thì khác nhau. Do đó lựa chọn các chất này phù hợp cho các chủng thì quan trọng trước khi áp dụng. Ở
Thái Lan nghiên cứu trên bột khoai mỳ chỉ ra rằng bột khoai mỳ có thể sử dụng cho chế
phẩm dạng lỏng cho mục tiêu kinh tế (giảm giá thành). Ý tưởng chọn các chất sẵn có tại
địa phương và có lợi về mặt kinh tế cho sản xuất là một ý tưởng hay. Hạt đậu tương hay lạc sau khi nhiễm rhizobia được gieo vào đất mà khi đó nhiệt độđất có thể lên đến 400C (Hafee FY et al., 1991) trong khi đó nhiệt độ cao là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tồn tại của rhizobia và cốđịnh đạm sinh học. Nhiệt độđất ở mùa khô tại Việt nam, đặc biệt trên cát (vùng miền Trung và Đông Nam bộ) , thì cao. Yếu tố này dẫn đến một gợi ý cho nghiên cứu đối với các công thức chế phẩm dạng lỏng. Một ý khác liên quan đến chế
phẩm dạng lỏng là bao gói. Túi polypropylen thường được sử dụng. Tuy nhiên túi này dễ
bị vỡ khi vận chuyển xa, chai plastic có thể là một giải pháp.
Trong cả hai công nghệ sản xuất (trên nền than bùn và dạng lỏng) thì các chủng rhizobia nhất thiết phải tăng trưởng tốt trong môi trường nhân sinh khối. Các môi trường dinh dưỡng này thông thường bao gồm nguồn C, N, khóang chất và các vi lượng. Nguồn C là các lọai đường như glucose, sucrose, manitol và các nguồn khác như glycerol cho bradyrhizobia. Để giảm giá thành cho sản xuất chế phẩm một nghiên cứu sử dụng khoai mỳ cho mục đích thay thế môi trường hiện sử dụng đã được tiến hành (Panlada Tittaburtr, 2005). Tuy nhiên, các điều kiện cho quá trình đường hóa bởi nấm mốc và biến đổi thành glycerol bởi nấm men cần phải được kiểm sóat tốt. Trong thí nghiệm của chúng tôi sản phẩm của quá trình này (hàm lượng đường và glycerol thay đổi).
Trong khóa đào tạo này chúng tôi không chú trọng đến quản lý chất lượng sản phẩm bởi vì chúng tôi đã học quản lý chất lượng trong một khóa học trước đó vào tháng 2-3/2007 tại Tp Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, trong khóa đào tạo này chúng tôi có thực hành kỹ thuật
58
trồng cây trong các túi sinh trưởng để kiểm tra chất lượng chế phẩm. Kỹ thuật này rất hiệu quả bởi vì tại Việt nam phòng thí nghiệm của chúng tôi không lớn để có thể áp dụng hệ thống Leonard. Hơn nữa, phương pháp cải tiến này giảm chi phí vận hành như là giảm
điện năng cho đèn và máy lạnh. Nó cũng giảm chi phí công lao động. Tại OPI sau khóa
đào tạo chúng tôi đã thiết lập một phòng nuôi cây và áp dụng kỹ thuật túi tăng trưởng cho mục đích quản lý chất lượng chế phẩm vi sinh cố định đạm. Hệ thống này họat động rất hiệu quả cho kiểm tra chất lượng chế phẩm cho cây lạc (sử dụng cây ciratro). Đối với đậu tương chúng tôi cần phải cải tiến hơn nữa.
____________________________________
Ths. Trần Yên Thảo
Trưởng nhóm Nghiên cứu Cốđịnh đạm Sinh học tại OPI Chủ nhiệm dự án 013/06VIE phía Việt nam
59
PHỤ LỤC 3
Báo cáo Đào tạo về Công nghệ Sản xuất chế phẩm Vi sinh cố định đạm
Trường Đại học Công nghệ Suranaree, Thái lan
5 – 19 tháng 10 năm 2008
1. Giới thiệu và mục tiêu
Đào tạo này là một phần nội dung của dự án số 013/06VIE “Thay thế phân bón hoá học N bằng chế phẩm vi sinh cốđịnh đạm cho cây họđậu tại Việt nam để tăng lợi nhuận cho nông dân và bảo vệ môi trường”. Mục tiêu của khoá đào tạo này là để tăng cường năng lực của các cán bộ nghiên cứu Việt nam để hoàn thiện hơn nữa công nghệ sản xuất và kiểm tra chất lượng tại Việt nam. Đào tạo này chú trọng vào thực hành hơn là lý thuyết và bao gồm nhận diện các chủng rhizobium, sản xuất chế phẩm ở qui mô nhỏ và lớn, và kiểm tra chất lượng sản phẩm.
2. Nhân sự
Đào tạo này được thiết kế bop73i GS.TS Nantakorn Bookerd và nhân viên của GS với thảo luận với TS. David Herridge, chủ nhiệm dự án, TS Rosaline Deaker và Chủ nhiệm dự án phía Việt nam, Trần Yên Thảo. GS. TS Nantakorn Bookerd tổ chức khoá đào tạo. Giảng viên đào tạo là:
- GS.TS Nantakorn Boonkerd, giám đốc đào tạo của Trường Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Công nghệ Suranaree.
- PGS.TS Neung Teaumroong, Trưởng khoa Nghiên cứu, Trường Đại học Công nghệ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Suranaree..
- PGS.TS Chokechai Wanapu, Giám đốc Trường Công nghệ Sinh học, Đại học Công nghệ Suranaree.
Trợ giúp đào tạo:
- Kamonluck Teamtisong, Quản lý Phòng thí nghiệm, Đại học Công nghệ Suranaree.. - Apinya Rattanachit, Trợ giúp Phòng thí nghiệm, Đại học Công nghệ Suranarre.. - Mallika Pakdee, Trợ giúp Phòng thí nghiệm, Đại học Công nghệ Suranarre
- Niruth Paepru, Trợ giúp Phòng thí nghiệm, Đại học Công nghệ Suranarre And Ms. - - Yupayong Chankhum, trợ giúp tổ chức đào tạo , Đại học Công nghệ Suranarre .
60 Có 4 cán bộ khoa học tham gia khoá đào tạo là:
- Trần Đăng Dũng, CBNC, Viện Khỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam., là một trong các cán bộ chính của viện này tham gia trong dự án.
- Nguyễn Thị Hiền, CBNC, Viện Nông hoá Thổ nhưỡng (SFI), là người chịu trách nhiệm sản xuất chế phẩm tại SFI.
- Ngô Thị Kiều Dương, CBNC của Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có dầu (IOOP). Trong dự án này, cô Dương nghiên cứu sản xuất chế phẩm, sản xuất chế phẩm tại IOOP.
- Trần yên Thảo, CBNC của IOOP, Chủ nhiệm Dự án bên cạnh việc nghiên cứu công nghệ, quản lý chất lượng
Có hai CBNC của Myanmar tham gia vào đào tạo này. Họ là các thành viên của dự án về
cố định đạm sinh học tại Myanmar và đến từĐơn vị Sản xuất, Khoa Nghiên cứu Nông học (DAR), Yezin, Myanmar.
3. Các hoạt động
• Khoá đào tạo bắt đầu vào ngày thứ hai, 6 tháng 10 với bài giảng tổng hợp về phân loại rhizobium bởi PGS.TS Neung Teaumroong. Vi khuẩn rhizobium cộng sinh với một số họ cây, chủ yếu là các cây họ đậu, và đóng góp số lượng lớn nhất và
độc nhất vào cốđịnh đạm sinh học trong bầu khí quyển. Các vi khuẩn nốt sần chia làm 2 loại:
• Rhizobium phát triển nhanh trong đó chức năng nốt sần (nif, fix) được mã hoá bởi megaplasmids công sinh (pSym)
Các học viên từ Việt nam và Myanmar trong lớp học về sản xuất chế phẩm qui mô nhỏ
Các học viên tại Trường Đại học Công
61
• Rhizobium phát triển chậm thì chức năng cốđịnh đạm và tạo nốt sần gắn liền với chromosome.
• Có hai loại nốt sần được hình thành là xác định và không xác định và được điều khiển bởi cây chủ.
Nốt sần xác định được hình thành ở các cây đậu nhiệt đới bởi Rhizobium và
Bradyrhizobium. Hoạt động của mô phân sinh thì không bền – hiện diện chỉ trong thời kỳ đầu hình thành nốt sần; sau đó tế bào đơn giản rộng ra hơn là phân chia, hình thành các nốt sần hình cầu.
Nốt sần không xác định hình thành ở các cây họđậu ôn đới (pea, clover, alfalfa); đặc biệt bởi Rhizobium spp. Nốt sần có hình trụ với một mô phân sinh bền; sự phát triển nốt sần hình thành những vùng theo các giai đoạn phát triển khác nhau.
Hệ thống phân loại được làm thành những nhóm dựa vào tính giống nhau. Đối với Prokaryotes, một giống là một bộ gồm các chủng tương tự nhau và khác biệt so với các nhóm khác. Hệ thống phân loại dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền hình thái. Nhóm
đầu gọi là “phân loại theo lối cổ truyền”: một loạt các đặc trưng của các chủng được xác
định theo nhóm phụ thuộc vào:. • hình thái học
• hoá học màng (phản ứng gram) • dinh dưỡng
• các đòi hỏi, nơi sống • numerical taxonomy
• khái niệm về gen của các prokaryote – cụm các sinh vật chia sẻ với nhau một gia tộc và khác nhau với các cụm khác. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân loại di truyền hình thái là:
• lựa chọn molecular chronometer như là xác định thay đổi tiến hoá.
• khoảng cách tiến hoá giữa 2 chủng được xác định bởi sự khác nhau về
nucleotide và thứ tự amino acid của các homologous macromolecules. Có một số các mô hình được sử dụng: phân bố phổ biến, tương đồng chức năng, vùng bảo tồn trình tự, và