2.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
Cách lấy mẫu: đánh số các bầu nấm trong lán, bốc thăm 5 vị trắ lấy mẫu. Khối lượng 0.5 kg.
Phương pháp xử lý mẫu: Sử dụng phương pháp sấy ựông khô mẫu. đây là phương pháp tách nước từ mẫu khi mẫu ựang ở trạng thái lạnh sâu.
Nấm nguyên liệu thu hoạch ở trại nấm ựược mang về phòng thắ nghiệm chia ra mũ nấm, thân nấm, phần phế phụ phẩm (PPP - đây là phần rễ giả và một phần thân nấm bị bỏ ựi với mục ựắch thương mại). Sau ựó ựể ở tủ lạnh ựông sâu -> Sấy ựông khô -> Nghiền -> Bảo quản -53oC
+ Nấm Sò trắng, Sò tắm: Phần PPP ựược bắt ựầu từ ựiểm cuối của thân cắt lên trên thân khoảng 1.5-2cm, phần mũ nấm là từ ựỉnh nấm ựến ựiểm cuối của phiến nấm, gần phần ựầu của thân.
+ Nấm Mỡ: Phần PPP là từ ựiểm cuối thân ựến thân khoảng 1-1.5cm, phần mũ ựược tách ra từ thân. Trong thương mại ựây là phần thường bỏ ựi tạo nên một lượng lớn phế phụ phẩm.
+ Nấm Ngọc châm, nấm đùi Gà: Tách phần mũ khỏi thân. PPP gồm một phần cuối của than tiếp xúc trực tiếp với giá thể và lớp màng bám vào giá thể.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 33
2.4.2 Phương pháp chuẩn bị dịch chiết mẫu
Dịch chiết nấm ựược chuẩn bị theo quy trình của Wi Young Lee và cs (2009), Hui-Yin Fu và cs (2001) với một vài thay ựổi nhỏ 0.5g bột nấm ựông khô ựược ựồng nhất trong 20ml etanol 70%, ựặt ở bể ổn nhiệt trong 1h ở 600C, sau ựó ly tâm 6000 vòng trong 10 phút, thu dịch trong. Dịch ựược cô quay chân không ựến khô sau ựó hòa loãng với 10ml nước cất. Tiếp tục vortex trong 5 phút, ly tâm thu dịch và bảo quản ở - 530C.
2.4.3 Phương pháp xác ựịnh hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số ựược xác ựịnh theo phương pháp Folin- Ciocalteu (Fu và cs, 2011).
Nguyên tắc
Dựa vào phản ứng oxy hóa khử các hợp chất phenol bằng thuốc thử Folin Ờ Ciocalteu tạo thành sản phẩm màu xanh thẫm, nồng ựộ polyphenol tỷ lệ thuận với cường ựộ màu xanh. Sau khi phản ứng ổn ựịnh màu ựem ựo ựộ hấp thụ màu của dung dịch ở bước sóng 760nm và dựa vào ựồ thị chuẩn của galic acid ta xác ựịnh ựược hàm lượng polyphenol trong mũ, thân và rễ nấm.
Tiến hành
B1. Pha loãng dung dịch với nồng ựộ thắch hợp (dịch thu ựược ở phần chiết mẫu)
B2. Hút 0.5 mL dung dịch mẫu ựã pha loãng vào ống nghiệm
B3. Thêm vào 2.5 mL dung dịch Folin-Ciocalteu (ựã pha loãng 10 lần) và ựồng nhất (bằng máy Vortex)
B4. để dung dịch phản ứng trong 4 phút
B5. Thêm 2 ml dung dịch Na2CO3 7.5% và lắc ựều
B6. để dung dịch ở nhiệt ựộ phòng trong bóng tối trong 2h
B7. Tiến hành so màu ở bước sóng 760 nm.
Gallic acid ựược dùng làm chất chuẩn trong test này. Kết quả ựược biểu diễn theo mgGAE/100g (mg gallic acid equivalent/100g)
2.4.4 Phương pháp xác ựịnh hàm lượng L-ergothioneine (ERGO)
L-ergothioneine ựược xác ựịnh bằng phương pháp phân tắch sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của N.J. Dubost và cs, 2007.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 34 ỚTiến hành:
Phân cực L-ergothioneine trên lớp pha ựảo C-18, tốc ựộ dòng chảy là 0.5 ml/phút. độ hấp thụ quang học ở λ = 254nm. LCreal time là 30 phút.
Pha dung môi cho thắ nghiệm với Acetolnitril với nước với tỉ lệ Acetolnitril: Nước là 3:97. Lấy 100 ộl dịch chiết nấm cho vào ống nghiệm, hút tiếp 900 ộl dung môi ựã pha vào từng ống nghiệm. đồng nhất bằng máy Vortex. Lấy 20ộl dịch chiết ựã pha loãng bơm vào hệ thống HPLC và peak thu ựược tương ứng với thời gian ra peak của chất chuẩn L-ergothioneine khi xây dựng ựường chuẩn. Từ diện tắch của các peak và dựa vào ựường chuẩn L-ergothioneine ựể tắnh ra hàm lượng của L-ergthioneine có trong từng mẫu nấm.Kết quả ựược thể hiện bằng mg ERGO/100g.
2.4.5 Phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh kháng oxi hóa
Khả năng kháng oxy hóa ựược xác ựịnh bằng phương pháp DPPH (Tabart và cs, 2009)
Nguyên tắc
DPPH (Diphenylpicrylhydzaryl) là gốc tự do màu tắm có ựộ hấp thụ quang cực ựại là A=517nm. Khi cho vào dung dịch chất khử có khả năng kháng oxy hóa vào dung dịch DPPH thì các gốc tự do bị khử và mất màu tắm. Dựa vào khả năng làm mất màu tắm gốc tự do DPPH của dịch chiết, xác ựịnh ựược khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết từ các bộ phận của nấm.
Tiến hành thắ nghiệm
B1. Hút 0.1ml dịch chiết mẫu ựã pha loãng ựến nồng ựộ nhất ựịnh vào ống nghiệm. Mẫu ựối chứng thay dịch chiết bằng nước cất.
B2. Hút thêm 2.9ml dung dịch DPPH vào ống nghiệm và ựể trong bóng tối trong 30 phút
B3. Tiến hành so màu ở 517 nm
% Kìm hãm ựược xác ựịnh theo công thức: AA (%) = (ODựối chứng - ODmẫu)*100 / ODựối chứng
Trong ựó: ODựối chứng: độ hấp thụ quang của mẫu ựối chứng ODmẫu: độ hấp thụ quang của mẫu cần xác ựịnh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 35
Trolox Ờ một dẫn xuất của vitamin E ựược dùng làm chất. Khả năng kháng oxi hóa ựược xác ựịnh dựa trên ựường chuẩn mô tả mối tương quan giữa nồng ựộ trolox và % kìm hãm, ựược biểu diễn bằng ộmol TE/100g.
2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 36
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN