STT Hóa chất Thể tích (µl) 1 H2O 14,7 2 Buffer 10X 2 3 dNTP 10mM 0,4 4 Primer 0,8
5 Taq polymerase ( 1 UI/µl) 0,1
6 DNA khuôn 2
Tổng thể tích 20
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản vùng ITS là: 94 oC trong 4 phút, lặp lại 40 chu kỳ và trong mỗi chu kỳ, biến tính ở 94 oC trong 30 giây, tiếp hợp mồi ở 58 oC trong 60 giây, tổng hợp ở 72 oC trong 60 giây và bước kết thúc ở 72 oC trong 5 phút, lưu giữ ở 4oC .
Gen matK được khuếch đại với chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR là 94oC
trong 1 phút, phản ứng được lặp lại 35 chu kỳ và trong mỗi chu kỳ, biến tính ở 94oC trong 30 giây, tiếp hợp mồi ở 53oC trong 40 giây, tổng hợp ở 72oC cho 40 giây và bước kết thúc ở 72°C trong 5 phút.
Các sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di agarose gel 1,0% và được tinh sạch bằng Kit Gel QIAquick.
* Xác định trình tự các nucleotide của gen matK và ITS
Các sản phẩm PCR sau khi được khuếch đại gen matK và ITS được gửi đi giải trình tự ở công ty 1st BASE tại Singapore.
* Phân tích dữ liệu
Trình tự gen matK và ITS của các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự
được so sánh với trình tự các gen matK và ITS đã được công bố trên thư viện mã vạch BOLD và GenBank thông qua phần mềm chuyên dụng DNAstar 5.0 và BioEdit.
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của cây Ô đầu
3.1.1. Đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu là những căn cứ bước đầu quan trọng để phân loại loài thực vật, từ đó làm cơ sở cho việc xây dựng dữ liệu về thực vật nói chung và thực vật làm thuốc nói riêng, góp phần bảo tồn sự đa dạng tài nguyên thực vật.
Mẫu cây Ô đầu thu tại Hà Giang được định danh thuộc chi Aconitum
theo Đỗ Tất Lợi (2004) [12]. Cây Ô đầu được trồng tại vườn Thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và được sử dụng để nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu (Hình 3.1).
(Nguồn ảnh của tác giả và nhóm nghiên cứu chụp) Hình 3.1. Cây Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx)
A, B: Cây Ô đầu trồng tại vườn Thực nghiệm khoa Sinh học; C. Củ của cây Ô đầu; D, E: Lá Ô đầu.
Ô đầu là một cây thân thảo, sống một năm hoặc nhiều năm, cây Ô đầu cao khoảng 0,6 - 1 m, thân mọc thẳng đứng, có nhiều lông ngắn.
Rễ cây Ô đầu là rễ chùm, từ củ mọc ra nhiều rễ con với độ dài khác nhau trung bình dài từ 1-15 cm, rễ mọc thẳng không cong queo, trên rễ có nhiều lông nhỏ. Rễ có màu nâu vàng và đâm sâu xuống đất và phát triển theo chiều ngang (đối với củ phụ tử), phát triển theo chiều dọc đối với củ có hình con quay.
Củ có hình nón, dài 3 - 5 cm, đường kính 1 - 2,5 cm mọc thành chùm trong đó có củ mẹ và nhiều củ con. Củ mẹ là do rễ cái phình thành ngay ở dưới thân cây, củ mẹ có đặc điểm là nhẹ, rỗng và ở giữa có màu xám. Củ con được mọc ra từ cạnh cổ rễ cái, củ con thì chắc, nặng, phía trên đầu củ con có mang lá ngầm. Rễ cây Ô đầu có vị nhạt, sau hơi chát và và tê lưỡi.
Lá đơn nguyên, 3 thùy, mỗi thùy lại chẻ thành nhiều thùy không đều nhau (2 hoặc 3 thùy), mép lá hình răng cưa, mọc tròn xung quanh củ, không có lá kèm, xanh đậm, nhẵn và có lông ở mép lá. Mặt trên có màu đậm hơn mặt dưới. Ngoài ra còn có một số lá có hình dạng khác như: lá không có hình răng cưa, lá chẻ 2 thùy gân lá dạng bản. Lá cây con hình tim, gần như tròn, tựa như lá ngải cứu. Lá cây Ô đầu mọc so le và sắp xếp theo hình xoắn ốc. Cuống lá dài, trung bình từ 1- 4 cm, có màu xanh hoặc màu tím đậm, trên cuống cũng có lông nhỏ. Phiến lá rộng khoảng từ 5 – 12 cm, gân lá hình lông chim, nhẵn hai mặt, có màu sắc giống với phiến lá.
(Nguồn ảnh của nhóm nghiên cứu chụp) Hình 3.2. Cơ quan sinh sản của cây Ô đầu
Hoa to, màu xanh tím với nhiều nhị hoa mọc thành chùm dày và dài khoảng từ 10 - 20 cm. Bông hoa có từ 2 - 10 cánh, hai cánh hoa trên to, cánh hoa khác thì nhỏ hoặc không hình thành, có túi rỗng ở đỉnh để chứa mật hoa, lá bắc nhỏ, lá đài phía sau giống hình mũ nông. Hoa nở vào tháng 10 - 11. Quả Ô đầu thuộc dạng quả nang dài khoảng 23 mm, mỗi nang có chứa nhiều hạt. Hạt có vẩy ở trên mặt. Đối chiếu những đặc điểm hình thái các cơ quan bộ phận như rễ, củ, thân, lá, hoa, quả, hạt của cây Ô đầu với mô tả về các loài Ô đầu ở Việt Nam theo Đỗ Tất Lợi, kết quả cho thấy mẫu cây Ô đầu thu tại Quản Bạ - Hà Giang mang các đặc điểm của loài Aconitum carmichaelii Debx. Như vậy, dựa trên các đặc điểm hình thái bước đầu có thể kết luận mẫu Ô đầu thu tại Quản Bạ - Hà Giang thuộc loài Aconitum.
3.1.2. Cấu tạo giải phẫu của cây Ô đầu
3.1.2.1.Cấu tạo giải phẫu lá cây Ô đầu
Lá là một cơ quan của thực vật và là phần phụ thuộc ở bên chính của thân cây, lá thực hiện các chức năng quang hợp, trao đổi khí và hô hấp. Ngoài ra lá cây còn có chức năng sinh sản sinh dưỡng, dự trữ hoặc tự vệ ở thực vật. Lá cây có cấu tạo bao gồm cuống lá, gân lá, phiến lá. Trên lá chứa nhiều tế bào mô dậu, khí khổng và lục lạp [2].
Quan sát lớp biểu bì dưới của lá gồm tế bào khí khổng và tế bào biểu bì. Khí khổng là một thành phần cấu tạo của biểu bì, là cơ quan chuyên hóa thực hiện chức năng trao đổi khí và thoát hơi nước (Hình 3.3). Khí khổng có cấu tạo gồm 2 tế bào chuyên hóa hình hạt đậu có mặt lõm úp vào nhau (gọi là tế bào khí khổng) hai đầu gần dính với nhau chừa ra khe khí khổng ở giữa (gọi là vi khẩu) để liên thông giữa khoảng gian bào thịt lá với không khí xung quanh. Tế bào khí khổng được cấu tạo bởi 2 thành: thành mỏng và thành dày. Thành mỏng ở phía ngoài có sức đàn hồi mạnh, thành dày ở phía trong và cứng. Trong tế bào khí khổng chứa nhiều lục lạp để thực hiện quá trình quang hợp. Các tế bào biểu bì mặt dưới lá có hình đa giác, thành tế bào không thẳng
và uốn theo dạng zíc zắc tạo thành thùy sâu hình răng lược.Vì vậy, khi quan sát tiêu bản lớp biểu bì lá dễ dàng phân biệt được tế bào khí khổng với tế bào biểu bì lá khác dựa trên hình thái và màu sắc.
Ở lớp biểu bì trên (Hình 3.4) của lá gồm các tế bào biểu bì và các lông. Các tế bào biểu bì trên có hình đa giác, không thẳng, uốn theo dạng zíc zắc nhưng không tạo thành các thùy sâu như các tế bào biểu bì mặt dưới của lá. Ở mặt trên của cây Ô đầu không quan sát thấy các tế bào khí khổng nhưng có xuất hiện các lông đơn bào phân bố rải rác.
Sự khác nhau về khí khổng ở 2 lớp biểu bì là vì mặt trên của lá tiếp xúc với ánh sáng Mặt Trời nhiều hơn, nếu mặt trên có nhiều khí khổng thì mặt trên sẽ thoát hơi nước nhanh hơn rất nhiều so với mặt dưới. Khi đó, lá sẽ nhanh khô héo và chết.
Hình 3.4. Lớp biểu bì trên của lá cây Ô đầu
Cuống lá Ô đầu có hình trụ, mặt trên lõm, mặt dưới lồi, có đối xứng hai bên, mặt phẳng đối xứng đi qua giữa mặt trên và mặt dưới.
Hình 3.5 trình bày cấu tạo cắt ngang cuống lá Ô đầu. Cuống lá gồm biểu bì là lớp ngoài cùng, được cấu tạo bởi các tế bào hình tròn nhỏ, nằm ngang, sắp xếp sít nhau theo chiều dài của cuống, vách mỏng và thấm cutin có tác dụng bảo vệ tế bào. Bên ngoài cuống lá có các lông đơn bào bao phủ.
Hình 3.5. Cấu tạo sơ cấp cuống lá
1. Lông đơn bào; 2. Lớp biểu bì; 3. Lớp tế bào mô dày; 4. Mô mềm vỏ; 5. Bó libe; 6. Bó gỗ; 7. Khoang trống
Quan sát cấu tạo lát cắt ngang của cuống lá từ ngoài vào trong gồm có: Ngoài cùng là lông đơn bào, tiếp đến là lớp biểu bì có màng tế bào đã hóa cutin, tiếp lớp biểu bì là lớp mô dày, gồm các tế bào hình tròn, kích thước tương đối đều nhau, sắp xếp sít nhau cụ thể: gồm 2 lớp tế bào (có lớp màng tế bào dày lên làm cho thân cây cứng), đặc biệt số lượng tế bào mô dày ở góc nhiều hơn so với ở phía ngoài và có tác dụng nâng đỡ. Tiếp theo lớp tế bào mô dày là mô mềm vỏ, bao gồm những tế bào sống có chứa nhiều lục lạp, tế bào hình tròn, xếp sít nhau, kích thước không đều lớn dần từ ngoài vào trong, có màng mỏng. Bên trong là hệ dẫn: gồm các bó libe và bó gỗ, các bó dẫn xếp xen kẽ giữa các bó dẫn to và bó dẫn nhỏ, xếp xung quanh thiết diện của cuống lá, bó libe phía ngoài và bó gỗ phía trong. Xung quanh các bó dẫn là các tế bào bao mô cứng. Ở giữa cuống lá là các khoảng trống.
3.1.2.2. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang rễ Ô đầu
Rễ là cơ quan sinh dưỡng dưới đất của cây, có nhiệm vụ chủ yếu là hút nước và muối khoáng hòa tan để chuyển lên thân và lá. Rễ còn có chức năng giữ chặt cây vào đất [2].
Hình 3.6. Cấu tạo rễ cây Ô đầu
1. Ngoại bì; 2. Lớp mô mềm vỏ; 3. Vòng nội bì; 4. Bó gỗ; 5. Bó libe; 6. Mô mềm ruột
Cấu tạo giải phẫu cắt ngang rễ qua miền hấp thụ gồm lớp ngoại bì, mô mềm vỏ, trụ giữa. Biểu bì gồm các tế bào hình ô van, màng mỏng, xếp sát nhau chỉ gồm một lớp tế bào, trên biểu bì có nhiều lông hút do các tế bào biểu bì kéo dài ra, mọc theo thứ tự hướng ngọn. Vỏ sơ cấp từ ngoài vào trong gồm vỏ ngoài, mô mềm vỏ, vỏ trong. Vỏ ngoài nằm ngay dưới biểu bì gồm một hoặc vài lớp tế bào, màng thấm bần (Hình 3.6).
Mô mềm vỏ: gồm các tế bào có màng mỏng, kích thước đều nhau, sắp xếp thành các vòng tròn đồng tâm, không chứa diệp lục. Vỏ trong là lớp trong cùng của vỏ sơ cấp thường có đai caspari (vòng nội bì), tế bào có hình chữ nhật, là một khung hóa bần của màng tế bào vỏ trong tại các vách xuyên tâm nên việc dẫn truyền vẫn được thực hiện.
Vòng nội bì (hay đai caspari) bao gồm một hàng tế bào khá đều đặn với chức năng làm giảm bớt sự xâm nhập của nước và kiểm soát dòng nước cùng chất khoáng trước khi vào trụ giữa.
Trụ giữa là phần giữa của rễ, gồm vỏ trụ nằm ngay sát vỏ trong có khả năng phân chia để tạo rễ bên, gồm 2 - 3 hàng tế bào đều đặn. Hệ thống dẫn: gồm các bó gỗ và bó libe riêng biệt, xếp xen kẽ dưới vỏ trụ và vòng quanh trụ giữa. Gỗ sơ cấp: phân hóa hướng tâm, gỗ trước xuất hiện đầu tiên nằm dưới vỏ trụ, gỗ sau nằm phía trong gồm các mạch lớn hơn, vách tế bào dày. Libe sơ cấp phân hóa hướng tâm, libe trước nằm ngoài, libe sau nằm ở phía trong, có các tế bào kèm cạnh mạch libe, có mô mềm, sợi libe. Libe và gỗ không tiếp giáp với nhau, giữa chúng có những tế bào không phân hóa về sau các tế bào này phát triển thành tầng phát sinh trụ.
3.1.2.3. Đặc điểm giải phẫu cắt ngang thân cây Ô đầu
Thân cây là một bộ phận trên cơ thể thực vật . Thân cây chuyển tiếp giữa gốc rễ với cành, lá. Thân có chức năng dẫn truyền nước, muối khoáng và
các chất hữu cơ đi nuôi cơ thể thực vật, thân có thể đảm nhiệm chức năng nâng đỡ cây và dự trữ chất dinh dưỡng.
Cấu tạo giải phẫu thân non được đặc trưng bởi sự đối xứng tỏa tròn và sự chuyển hóa rất cao của các mô. Trên lát cắt thân cây Ô đầu, có thể phân biệt bởi 3 vùng cơ bản là: biểu bì, vỏ sơ cấp và trụ giữa.
Ngoài cùng là mô thứ cấp (bần) bắt màu nâu xám, có vai trò bảo vệ và che chở cho những tầng trong của cây.
Lớp tế bào biểu bì: gồm 1 lớp tế bào và có màng hóa cutin
Vỏ sơ cấp: Nằm trong lớp biểu bì, gồm các lớp tế bào hình chữ nhật hoặc bầu dục, đôi khi hình phiến. Vỏ sơ cấp gồm hai loại mô: Mô dày và mô mềm vỏ.
Mô dày: Gồm 3 lớp tế bào xếp sít nhau, ít có khoảng gian bào, tế bào hình tròn hoặc hình bầu dục. Trong tế bào mô dày gồm những tế bào sống, có màng sơ cấp dày, không hóa gỗ, vẫn bằng xelluloz. Mô dày là mô nâng đỡ các cơ quan đã trưởng thành không sinh trưởng tiếp nữa. Đặc điểm tế bào gồm những tế bào thứ cấp có màng dày hóa gỗ, các tế bào rất khác nhau về hình dạng, cấu tạo và tính chất. Khi trưởng thành, nội chất tiêu biến - gồm các tế bào chết. Các tế bào tập trung thành từng đám mô dày xếp gần như liên tục tạo thành 1 vòng. Kích thước của đám mô dày không đều dày lên hình phiến làm cho thân cây cứng.
Hình 3.7. Cấu tạo sơ cấp thân cây Ô đầu
1. Ngoại bì; 2. Lớp mô dày; 3. Mô mềm vỏ; 4. Các tế bào libe cứng; 5. Bó libe; 6. Bó gỗ; 7. Mô mềm ruột
Mô mềm vỏ: Gồm các lớp tế bào hình bầu dục, to hơn các tế bào mô dày, xếp thưa để lại nhiều khoảng gian bào, có các bào quan, thể vùi. Trong mô mềm vỏ có diệp lục, chức năng chính là dự trữ và dinh dưỡng
Phần trụ giữa chiếm 1 vị trí quan trọng trong thân: phía ngoài cùng trụ giữa là các tế bào vỏ trụ, lớp mô mềm không dẫn truyền phần libe và vỏ. Phía trong của trụ là hệ dẫn và tủy.
Hệ dẫn của thân gồm gỗ và libe phát triển thành vòng liên tục, phần gỗ phát triển với nhiều mạch gỗ và mô mềm gỗ, mạch có hình đa giác xen lẫn với các tế bào mô mềm gỗ bao quanh.
Các tế bào libe cứng được cấu tạo bởi những tế bào có vách dày hóa gỗ ít nhiều, có nhiều ống nhỏ xuyên qua để thực hiện quá trình trao đổi chất.
Bó gỗ có kích thước lớn gồm các tế bào nối với nhau thành ống rỗng dài từ rễ lên lá, các ống xếp sít sát nhau sao cho các lỗ bên của chúng thông với nhau tạo mối liên hệ ngang giữa các ống. …
Mô mềm ruột: gồm những tế bào sống chưa phân hóa nhiều, vách vẫn mỏng và bằng cellulose. Các tế bào mô mềm có thể xếp xít vào nhau, khi đó chúng có hình đa giác; hoặc đã bắt đầu bong ra ở góc tế bào thành những khoảng gian bào rõ rệt có nhiệm vụ liên kết các mô khác với nhau, đồng thời còn làm chức năng đồng hóa hay dự trữ.
Mẫu cây Ô đầu thuộc thân thảo vẫn mang đặc điểm chung của thực vật 2 lá mầm: Bó mạch có cấu trúc tạo thành một vòng tròn như ở họ Đậu - Fabaceae, họ Khoai lang - Convolvulaceae. Có hai vòng bó mạch tách rời nhau như ở các họ Bầu bí - Cucurbitaceae: Dưa chuột - Cucurmis sativus L., Su su - Sechium edule (Jacq.). Tuy nhiên, khi nghiên cứu cấu tạo giải phẫu mẫu cây Ô đầu đã cho thấy có một số điểm khác biệt. Đó là sự khác nhau trong phân bố khí khổng ở 2 lớp biểu bì trên, biểu bì dưới của lá: Lớp biểu bì trên không có khí khổng và khí khổng phân bố ở lớp biểu bì dưới. Bên ngoài cuống lá có các lông đơn bào bao phủ [9].
3.2. Kết quả phân lập đoạn gen matK và trình tự ITS