Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4. Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định khi nuôi cấy trong môi trường lỏng (bình
(bình bioreactor)
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục
Nuôi cấy sinh khối bằng hệ thống bioreactor sục khí liên tục là quá trình nuôi cấy mẫu trong dung dịch dinh dưỡng lỏng kết hợp với tăng cường độ thoáng khí. Khi nuôi cấy trong bình bioreactor mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên làm cho tốc độ tăng trưởng và phát triển được tăng nhanh. Do đó chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục với mật độ 20 mẫu tương đương 17,23 g trong thể tích môi trường dinh dưỡng 1,0 lít và 2,0 lít để khảo sát khả năng tăng sinh khối.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục
CT Thể tích môi trường (lít) Khối lượng ban đầu (g) Khối lượng TB rễ tươi (g) Khối lượng rễ tăng (g) Chất lượng rễ 1 1,0 17,82 143,8 125,98 Tốt 2 2,0 18,61 115,38 96,77 Tốt CV (%) LSD.05 2,3 0,37
Kết quả nhận được cho thấy: Cùng khối lượng đầu vào như nhau khi nuôi với thể tích dinh dưỡng khác nhau cho kết quả tăng sinh khối là khác nhau. Với trọng lượng mô tươi cấy ban đầu là 17,82 g mô tăng sinh khối trong bioreactor chứa thể tích môi trường dinh dưỡng 1,0 lít và 2,0 lít đạt lần lượt 143,8g (tăng 125,98 g) và 115,38 g (tăng 96,77 g) sau 40 ngày nuôi cấy.
Với LSD.05 = 0.37 và CV = 2,3% cho thấy 2 công thức có sự sai khác có ý nghĩa. Giải thích điều này là do cùng tốc độ sục khí nhưng trong thể tích nhỏ hơn tốc độ lưu thông của môi trường lỏng cao hơn, giúp quá trình trao đổi chất của mẫu nuôi cây diễn ra mạnh, hấp thu dinh dưỡng tốt nên mẫu sinh trưởng nhanh hơn. Như vậy khi nuôi cấy với mật độ 20 mẫu/ bình bioreactor (2l) thì thể tích dinh dưỡng tối ưu cho sự tăng trưởng của mẫu nuôi cấy là 1,0 l.
Theo Escalona và cs [42] khi nuôi cấy dứa bằng bình bioreactor đã xác định thể tích môi trường từ 5,0 đến 50,0 ml/mẫu cấy, hệ số nhân chồi tăng từ 8,3 chồi lên đến 23,9 chồi sau 40 ngày nuôi cấy. Thể tích nhiều hơn tỏ ra không hiệu quả cho nhân chồi. Giải thích hiện tượng này tác giả cho rằng trong quá trình nuôi cấy, thực vật tiết ra ngoài môi trường các hợp chất kích thích tạo chồi và với thể tích lớn các hợp chất này bị pha loãng đi.
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng
Bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng ( 40 ngày)
CT Khối lượng ban đầu (g) Khối lượng TB rễ tươi (g) Khối lượng rễ tăng (g) Chất lượng rễ 1 (1 ống sục khí) 17,23 111,13 93,9 TB 2 (2 ống sục khí) 18,61 143,8 125,19 Tốt CV (%) LSD.05 5,3 3,4
Tốc độ sục khí với 2 ống sục cho kết quả cao (tăng 125,19 g), với một ống sục cho kết quả thấp hơn (tăng 93,9 g).
Với giá trị LSD = 3,4; CV = 5,3% cho thấy công thức 2 có sự sai khác có ý nghĩa với công thức 1 với mức tin cậy 95%.
Kết quả trên có thể được giải thích như sau: tốc độ sục khí ảnh hưởng rất lớn đến việc tăng sinh khối rễ. Khi tốc độ sục khí nhanh thì quá trình trao đổi chất được diễn ra liên tục, giúp tế bào thực vật phát triển một cách nhanh chóng.
Trong thí nghiệm này, rễ tăng trưởng còn nhờ vào nguồn carbon hữu cơ có mặt trong môi trường nuôi cấy, chủ yếu là của đường sucrose. Rễ cây thông qua hô hấp sẽ tiêu thụ carbon đồng hóa để có năng lượng cần thiết cho sự duy trì và gia tăng sinh khối, vì vậy tiến trình này cần thiết phải có sự hiện diện của oxy. Theo Yu và cs. (2000) [55], sự thông khí của hệ thống nuôi cấy là yếu tố quan trọng trong sự hình thành rễ bất định. Soffer và Burger (1988) [50] cũng đã chứng minh rằng oxy hòa tan thiết yếu cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định.
Qua đó ta có kết luận rằng với tốc độ sục khí là 2 ống sục cho kết quả cao nhất. Và kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Quỳnh cùng cs trong nghiên cứu rễ bất định ở cây Đương quy Nhật Bản [28].
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu thí nghiệm trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:
1) Môi trường thích hợp để cảm ứng tạo rễ bất định cây Đảng Sâm là môi trường MS.
2) Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo và rễ bất định: Nồng độ 2,4 D thích hợp cho sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Đảng sâm là 2 mg/L, IBA với nồng độ 2 mg/L là thích hợp cho khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm.
3) Ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ, đường đến sự tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm: Peptone là tối ưu cho tăng trưởng sinh khối rễ bất định Đảng sâm với nồng độ 2 g/L, hàm lượng đường 30g/L là thích hợp cho khả năng tăng trưởng sinh khối rễ bất định Đảng sâm.
4) Ảnh hưởng của tốc độ sục khí và thể tích môi trường đến khả năng nhân nhanh sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trên môi trường lỏng (bioreactor) với mật độ 20 mẫu cấy thì thể tích phù hợp cho sự tăng trưởng sinh khối rễ bất định Đảng sâm là 1 lít, tốc độ sục khí với 2 ống sục là tốc độ sục tối ưu để tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm.
2. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy trong bình bioreactor với các thể tích lớn hơn để thu được sinh khối lớn.
Nghiên cứu phân tích, tách chiết các hoạt chất có trong sinh khối rễ Đảng sâm nuôi cấy.
TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng Việt
1. Ngô Triệu Anh (2011), Y Dược học Trung Hoa, NXB Y học.
2. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ hạt kín ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Đông, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mẫn, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập 1, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội
4. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
5. Ngô Xuân Bình (2010), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB khoa học kỹ thuật. 6. Bộ Khoa học và công nghệ, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam (2007), Sách đỏ
Việt Nam, Phần II-Thực vật, NXB. Khoa học tự nhiên & công nghệ, Hà Nội.
7. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam (in lần thứ 3), NXB Y học, Hà Nội, tr. 310-311. 8. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội.
9. Chính Phủ (2002), Nghị định số 48/2002/NĐ-CP ngày 22 tháng 4 năm 2002. Quy định danh mục thực vật, động vật rừng quý hiếm và chế độ quản lý, bảo vệ.
10. Nguyễn Minh Chơn (2004), Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Khoa Nông nghiệp- Đại học Cần Thơ.
11. Hoàng Minh Chung, Phạm Xuân Sinh, Nguyễn Mạnh Tuyển (2002), “ Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng Sâm Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 7(1), tr:36-42
12. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
13. Nguyễn Thái Hà (2003), Nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các giống hoa Lilium spp, Báo cáo khoa học Hội nghị sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và kỹ thuật, tr. 875-879
14. Nguyễn Thị Thu Hằng, Trịnh Thị Lan Anh, Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Trung Thành (2015), “Ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng và thành phần dinh dưỡng (đường, benzyl adenine, chlorocholine chloride) đến sự tạo củ bi Khoai tây (Solanum tuberosum L.) trong nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN:
Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 31 (3), tr. 9-15.
15. Nguyễn Trung Hậu, Trần Văn Minh (2015), “Nuôi cấy mô lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa L. Harms) tạo rễ tơ và nhận biết hoạt tính saponin tích lũy”, Tạp chí Khoa học Đại học An Giang, 7(1), tr. 75-83.
16. Đinh Thị Hoa, Đoàn Thị Thùy Linh (2015),“Đặc điểm phân bố loài Đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook. F. et Thoms) tại khu bảo tồn thiên nhiên Copia, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La”- Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5
17. Nguyễn Thị Ngọc Hương, Võ Thị Bạch Mai (2009). Tìm hiểu sự phát sinh hình thái rễ trong nuôi cấy in vitro cây nhàu (Morinda citrifolia L.), Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 12(17): 100-105
18. Trần Thanh Hương, Bùi Trang Việt, Feng Teng Yung (2009). Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong sự hình thành rễ bất định từ các khúc cắt mang chồi ở một vài giống chuối (Musa sp.), Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ,
12(9): 23-30.
19. Lê Đình Khả, Hà Huy Thịnh, Nguyễn Văn Thảo (2003),Chọn tạo và nhân giống cho một số loài cây trồng rừng chủ yếu ở Việt Nam, NXB nông nghiệp, Hà Nội. 20. Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình các chất điều hòa
sinh trưởng thực vật, NXB Giáo dục Việt Nam.
21. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011) “Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh trong nuôi cấy in vitro”, Tạp chí khoa học DHQGHN, Khoa học tự nhiên và công nghệ, 27, tr. 30-36
22. Hà Thị Loan, Dương Hoa X , Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hoàng Quân, Vũ Thị Đào, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Gontier (2014) “Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis bằng phương pháp chuyển gen ROL nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí sinh học, 36(1se): 293-300.
23. Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học
24. Võ Thị Bạch Mai (2004), Sự phát triển chồi và rễ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP HCM.
25. Trần Văn Minh (2013), Công nghệ Sinh học thực vật, Giáo trình dành cho Cao học và Nghiên cứu sinh, Trường Đại học Nông Lâm TPHCM.
26. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
27. Trương Quỳnh Như, Võ Thanh Phúc, Lê Thị Thủy Tiên (2015), “Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự hình thành và tăng sinh của rễ bất định dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”, Tạp chí phát triển KH&CN, 18(5), tr 75 – 86. 28. Nguyễn Thị Quỳnh, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thư (2013) “Nghiên
cứu sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định từ nuôi cấy in vitro của cây Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa)”, Tạp chí sinh học, tr35(3se):165-173. 29. Hoàng Thị Sản (2009), Phân loại thực vật, NXB Giáo dục
30. Bùi Đình Thạch (2016). Nghiên cứu tạo rễ tơ cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) và khảo sát khả năng tạo plumbagin trong nuôi cấy in vitro, Luận án tiến sĩ Viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
31. Nguyễn Quang Thạch (2009), Cơ sở Công nghệ sinh học-tập 3, Nxb Giáo dục.
32. Nguyễn Đức Thành (2002), Nuôi cấy mô tế bào thực vật- nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông nghiệp.
33. Nguyễn Trung Thành, Paek Kee (2008), “Nhân nhanh rễ bất định Nhân sâm Panax ginseng C.A. Meyer và ảnh hưởng của một số nhân tố lý hóa lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm trao đổi chất ginsenosides”, Tạp chí khoa học DHQGHN, Khoa học tự nhiên và công nghệ 24, tr 318-323.
34. Ninh Thị Thảo , Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thuỳ Linh, Nguyễn Tuấn Minh, Nguyễn Quỳnh Chi, Trần Thị Anh Đào (2016), “Nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ bất định cây ba kích (Morinda officinalis How)”, Tạp chí KH Nông nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 6: 921-930
35. Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Phương Thảo (2015), “Nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza bunge)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, Vol.13, No. 2: 251-258
36. Lê Thị Thúy, Trịnh Mộng Nhi, Phạm Văn Lộc (2014), “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo rễ cà rốt trong nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, 5(18): 62-67.
II. Tiếng Anh
38. Abdullahil, B. (2010), Growth, secondary metabolite production and antioxidant enzyme response of Morinda citrifolia adventitious root as affected by auxin and cytokinin, Plant Biotechnology Reports, 4(2): 109-116
39. Amoo, S. O., Aremu, A. O., Staden, J. (2013), Shoot proliferation and rooting treatments influence secondary metabolite production and antioxidant activity in tissue culture-derived Aloe arborescens grown ex vitro. Plant Growth Regulators, 70: 115-122
40. Bui Dinh Thach, Le Nguyen Tu Linh, Nguyen Thi Thuy Van, Trinh Thi Ben, Mai Truong, Nguyen Huu Ho (2014), A study on the formation and development of Panax bipinnatifidus Seem. adventitious root, Journal of Developmental Biology and Tissue Engineering 6(1): 1-7 (ISSN: 2141-2251)
41. Demet A., Daradogan T. (2010), “The effect of carbon sources on in vitro
microtuberization of potato (Solanum tuberosum L.)”, Turkish Journal of Field Crops, 15(1), pp. 7-11.
42. Escalona M., Lorenzo J.C., Gonzales B.L., Daquinta M., Borroto C.G , Gozales J.I., Desjardine Y. (1999), “Pineapple (Ananas comosus L Merr.) micropropagation in temporary immersion system”, Plant Cell Rep, 18, pp. 743 – 748.
43. Gao X.F., Xu Z.H., Liu J.J., Ma L.P., Yin L.P., Jia W. (2006), “Adventitious root induction and in vitro culture of Panax notoginseng”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi.,
31(18), pp. 1485-8.
44. Geert-Jan De Klerk, Wim Van Der Krieken, Joke C. De Jong (1999), Review: The formation of adventitious roots: new concepts, new possibilities, In Vitro Cell. Dev. Bio Plant, 35, 189-199.
45. J.J. Zhong (1998), Production of ginseng saponin and polysaccharide by cell cultures of P. ginseng and P. notoginseng. Effects of plant growth regulators, Appl.
Biochem. and Biotechnol., 75:261.
46. Kim, J. S., Hahn, E. J., Yeung, E. C., Paek, K. Y. (2003), Lateral root development and saponin accumulation as affected by IBA or NAA in adventitious root cultures of Panax ginseng C. A. Meyer. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant, 39(2): 245-249
47. Lee Y., Lee D.E., Lee H.S., Kim S.K, Lee W.S., Kim S.H., M.W. (2011), “Influence of auxins, cytokinins, and nitrogen on production of rutin from callus and adventitious roots of the white mulberry tree (Morusalba L.)”, Plant cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 105(1), pp. 9-19.
48. Reis, R., Borges, A., Chierrito, T., de Souto, E., de Souza, L., Iacomini, M., de Oliveira, A., Goncalves, R. (2011), Establishment of adventitious root culture of
Stevia rebaudiana Bertoni in a roller bottle system. Plant Cell Tissue Organ Culture, 106: 329-335
49. San José, M. C., Romero, L., Janeiro, L.V. (2012), Effect of indole-3-butyric acid on root formation in Alnus glutinosa microcuttings, Silva Fennica, 46(5): 643-654. 50. Soffer H., Burgur D. W., 1988, Effects of dissolved oxygen concentrations in aero
hydroponics on the formation and growth of adventitious roots, J. Am. Soc. Hort. Sci., 113: 218-221
51. Son S.H., Choi S.M., Hyung S.J., Yun S.R., Choi M.S., Shin E.M., Hong Y.P. (1999) “Induction and culture of mountain ginseng adventitious roots and AFLP analysis for indentifying mountain ginseng”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 4(2), pp. 119-123.
52. Verstraeten I., Beeckman T., Geelen D. (2013), Adventitious root induction in
Arabidopsis thaliana as a model for in vitro root organogenesis, Methods in Molecular Biology, 959: 159-175.
53. Xu H., Park J. H., Kim Y. K., Park N., Lee S. Y., Park S. U. (2009), Optimization of growth and pyranocoumarins production in hairy root culture of Angelica gigas Naka,Journal of Medicinal Plants Research, 3: 978 – 981
54. Yew Lee, Dong-Eun Lee, Hak-Soo Lee, Seong-Ki Kim, Woo Sung Lee, Soo- Hwan Kim, Myoung-Won Kim (2011), Influence of auxins, cytokinins and nitrogen on production of rutin from callus and adventitious roots of the white mulberry tree (Morus alba L.), Plant Cell Tissue Organ Culture, 105, 9-19.
55. Yu T. A., Yeh S. D., Cheng Y. H., Yang J. S., (2000), Efficient rooting for establishment of papaya plantlets by