3.1. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật
Sáu chủng vi khuẩn và bốn chủng nấm men được nuôi cấy trên các ống eppendorf và theo dõi khả năng hình thành biofilm sau 24h. Khả năng tạo biofilm được đánh giá bằng việc bắt màu tím tinh thể và độ hấp phụ của tím tinh thể tại bước sóng 570nm, kết quả được trình bày ở Hình 3.1.
Hình 3.1. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật
So với chủng Acinetobacter calcoaceticus P23 là đối chứng dương (OD570
đạt 11,04), các chủng Acinetobacter sp. QN1 và Bacillus sp. B8 cho khả năng hình thành biofilm ở mức khá tốt sau 24h nuôi cấy, chỉ số OD570 đạt từ 9,58 đến 12,06. Đặc biệt 05 chủng Debaryomyces sp. BN5, Serratia sp. DX3, Debaryomyces sp. QNN1, Debaryomyces sp. QN5 và Trichosporon sp. B1 có khả năng hình thành biofilm rất tốt với OD570 đạt từ 15,23 đến 27,4. Hai chủng Bacillus sp. HY1 và
Rhodotorula sp. QNB3 có khả năng hình thành biofilm thấp nhất trong số các chủng
thí nghiệm.
Bảy chủng vi sinh vật bao gồm 4 chủng vi khuẩn Acinetobacter sp. QN1,
Bacillus sp. B8, Debaryomyces sp. BN5, Serratia sp. DX3 và 3 chủng nấm men
Debaryomyces sp. QNN1, Debaryomyces sp. QN5, Trichosporon sp. B1 được lựa
chọn để tiếp tục đánh giá tính đối kháng khi nuôi cấy chung trong các thí nghiệm tiếp theo. Gi á trị ∆O D5
3.2. Tính đối kháng của các chủng vi sinh vật
Bảy chủng vi sinh vật lựa chọn được cấy trên các đĩa thạch sao cho mỗi chủng đều được cấy cắt nhau từng cặp. Sau 24h nuôi cấy các khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn và nấm men phát triển tốt trên môi trường MPA và Hanssen (Hình 3.2). Từ kết quả đạt được sau 24h ở Hình 3.2.a chúng ta có thể thấy được các chủng giống phát triển tốt, các đường ria rõ nét không có hiện tượng bị đứt đoạn hay không mọc. Điều đó chứng tỏ trong quá trình phát triển không xảy ra hiện tượng cạnh tranh hay ức chế sự phát triển lẫn nhau. Tuy nhiên tại Hình 3.2.b, tại đoạn cắt nhau giữa chủng Trichosporon sp. B1 và chủng Debaryomyces sp. QN5 xuất hiện sự không mọc của các khuẩn lạc của chủng Trichosporon sp. B1, đoạn cắt giữa chủng Trichosporon sp. B1 với chủng Acinetobacter sp. QN1 xuất hiện sự không mọc của các khuẩn lạc của chủng Acinetobacter sp. QN1, điều này cho thấy giữa chủng Trichosporon sp. B1 và 02 chủng Acinetobacter sp. QN1, Debaryomyces sp. QN5 có sự đối kháng nhau trong quá trình sinh trưởng. Qua đó, chúng tôi đã xác định được 06 chủng vi sinh vật bao gồm Acinetobacter sp. QN1, Bacillus sp. B8,
Debaryomyces sp. BN5, Serratia sp. DX3, Debaryomyces sp. QNN1 và
Debaryomyces sp. QN5 có khả năng tạo màng tốt và không có tính đối kháng lẫn
nhau, thuận lợi cho các nghiên cứu tiếp theo khi sử dụng chung các chủng vi sinh vật này trong cùng một canh trường nuôi cấy.
Tại các bước thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi thiết lập các mô hình đánh giá hiệu quả xử lý nước ô nhiễm dầu của biofilm hỗn hợp 6 chủng vi sinh vật lựa chọn.
Hình 3.2. Tính đối kháng của các chủng vi sinh vật lựa chọn
(1: Acinetobacter sp. QN1; 2: Bacillus sp. B8; 3: Debaryomyces sp. BN5; 4:
Serratia sp. DX3; 5: Debaryomyces sp. QNN1; 6: Debaryomyces sp. QN5;
3.3. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật trên vật liệu mang
Bốn loại vật liệu mang có những đặc tính phù hợp cho sự hình thành biofilm vi sinh vật, đây cũng là những loại vật liệu có giá thành rẻ và phổ biến tại Việt Nam. Hỗn hợp đa chủng vi sinh vật được thử nghiệm khả năng tạo biofilm trên các loại vật liệu mang lựa chọn nhằm tìm ra loại vật liệu mang phù hợp nhất để ứng dụng trong xử lý nước thải nhiễm dầu. Thí nghiệm đối chứng được triển khai trong mô hình không bổ sung vi sinh vật.
Các chủng vi sinh vật được tiến hành nuôi tĩnh trên mô hình 50 lít có gắn các module vật liệu mang. Sau 18, 24 và 36h nuôi cấy, bằng mắt thường có thể thấy môi trường vi sinh vật trong mô hình độ đục tăng dần do sự phát triển của hỗn hợp chủng vi sinh vật. Trên bề mặt vật liệu mang xuất hiện một lớp màng màu trắng chính là biofilm vi sinh vật được hình thành. Sau 18, 24 và 36h, mẫu vật liệu mang được thu thập và tiến hành xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp MPN, kết quả được trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khả năng tạo biofilm của vi sinh vật trên vật liệu mang
Vật liệu mang
CFU/cm3
18h 24h 36h
Biofilm ĐC Biofilm ĐC Biofilm ĐC
Sỏi nhẹ 6+2,6*107 0 4,35+4,08*1010 0 2,1+0,69*1012 6,6+3,16*102
Cellulose 3,45+0,94*107 0 2,25+0,78*108 0 4,25+0,9*109 4,5+1,56*102
Xơ dừa 9+4,5*108 0 2,55+0,52*1010 0 3,9+0,69*1012 4,5+1,56*102
Mút xốp 5,25+3,44*105 0 1,05+0,52*107 0 1,65+0,52*1010 5,7+3,64*102
Số lượng tế bào hỗn hợp chủng vi sinh vật trên các loại vật liệu mang đều đạt trên 109 CFU/cm3 sau 36h nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, trong đó số lượng vi sinh vật trên vật liệu mang xơ dừa tại tất cả các thời điểm kiểm tra đều cho kết quả cao nhất so với các loại vật liệu mang khác ở mức 9*108 sau 18h, 2,55*1010 sau 24h và 3,9*1012 sau 36h nuôi cấy. Khả năng tạo biofilm của hỗn hợp chủng vi sinh vật trên các vật liệu mang sỏi nhẹ và mút xốp ở mức 2,1*1012 (sỏi nhẹ) và 1,65*1010 (mút xốp) sau 36h. Vật liệu mang cellulose có số lượng vi sinh vật được ghi nhận thấp nhất ở tất cả các thời điểm kiểm tra, đạt mức 4,25*109 sau 36h. Ở thí nghiệm đối chứng, sau 36h có sự xuất hiện của các vi khuẩn xâm nhập từ điều kiện phòng với số lượng không đáng kể trong các vật liệu mang.
(a) (b)
Hình 3.3. Mô hình tạo màng sinh học trên vật liệu mang (a) Hình ảnh biofilm bám
trên vật liệu mang xơ dừa (b)
Bốn loại vật liệu mang trước và sau khi tạo biofilm được quan sát và so sánh cấu trúc trên kính hiển vi điện tử quét S-4800, kết quả được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Cấu trúc của vật liệu mang ở thí nghiệm đối chứng và thí nghiệm tạo
biofilm trên kính hiển vi điện tử quét
Tên mẫu Cấu trúc vật liệu mang ở thí nghiệm đối chứng
(không bổ sung vi sinh vật)
Cấu trúc vật liệu mang ở thí nghiệmtạo biofilm
(bổ sung vi sinh vật) Đặc điểm Mút xốp - Mút xốp có cấu trúc ô kín tròn với độ rỗng cao.
- Cấu trúc của biofilm trên vật liệu: các tế bào vi khuẩn và nấm men khu trú ở từng vị trí khác nhau, có sự liên kết chặt chẽ và bám chắc trên bề mặt. Kích thước tế bào vi khuẩn (0,5-1)*(1,2-2) µm; các tế bào nấm men hình tròn, to, đường kính khoảng 2-2,5 µm.
Tên mẫu Cấu trúc vật liệu mang ở thí nghiệm đối chứng (không bổ sung vi sinh
vật)
Cấu trúc vật liệu mang ở thí nghiệmtạo biofilm (bổ sung vi sinh vật) Đặc điểm Sỏi nhẹ - Sỏi nhẹ có cấu trúc vô định hình, có độ rỗng cao.
- Cấu trúc của biofilm trên vật liệu: các tế bào vi khuẩn và nấm men khu trú cùng với nhau, liên kết chặt chẽ. Các tế bào được bao phủ bởi lớp EPS xung quanh. Kích thước tế bào vi khuẩn (0,5- 1)*(1,2-2) µm; các tế bào nấm men hình tròn, to, đường kính 2- 2,5 µm. Xơ dừa
- Xơ dừa có cấu trúc vô định hình, có độ rỗng cao
- Cấu trúc của biofilm trên vật liệu: các tế bào vi khuẩn và nấm men khu trú cùng với nhau tại các phần rỗng của vật liệu mang và liên kết chặt chẽ với nhau. Các tế bào được bao phủ bởi lớp EPS xung
Tên mẫu Cấu trúc vật liệu mang ở thí nghiệm đối chứng (không bổ sung vi sinh
vật)
Cấu trúc vật liệu mang ở thí nghiệmtạo biofilm (bổ sung vi sinh vật) Đặc điểm quanh. Kích thước tế bào vi khuẩn (0,5- 1)*(1,2-2) µm; các tế bào nấm men hình tròn, to, đường kính 2- 2,5 µm Cellulose - Cellulose có cấu trúc dạng sợi, có độ rỗng thấp.
- Cấu trúc của biofilm trên vật liệu: các tế bào vi khuẩn và nấm men khu trú cùng với nhau, liên kết chặt chẽ và bám chắc trên bề mặt. Kích thước tế bào vi khuẩn (0,5-1)*(1,2-2) µm; các tế bào nấm men hình tròn, to, đường kính khoảng 2- 2,5 µm.
Xơ dừa là một loại vật liệu tự nhiên, cấu trúc vô định hình, có độ rỗng cao thuận lợi cho sự hình thành biofilm của các chủng vi sinh vật, đó cũng là lý do xơ dừa được sử dụng phổ biến làm vật liệu mang trong công nghệ biofilm xử lý nước thải trên thế giới [104, 105].
Theo Knezev [106], số lượng tế bào vi sinh vật trong biofilm hình thành trên mút xốp tương đương so với số lượng tế bào hình thành trên vật liệu mang dạng hạt từ carbon hoạt tính được ghi nhận là 1-4*1010 CFU/cm3, và cao hơn so với vật liệu
là cát. Trong khi đó các loại vật liệu mang là xơ dừa, sỏi nhẹ và cellulose có mật độ vi sinh vật cao hơn nhiều so với mật độ vi sinh của biofilm hình thành trên vật liệu mangcarbon hoạt tính dạng hạt và cát. Đồng thời mật độ vi sinh vật của biofilm trên vật liệu mang trong nghiên cứu này cũng cao hơn hẳn so với mật độ vi sinh trên các loại bùn hoạt tính đang sử dụng trong xử lý nước thải thường chỉ đạt từ 105 đến 108
CFU/cm3 [107, 108, 109].
Trong phương pháp xử lý sinh học, ngoài các yếu tố khả năng phân hủy các chất ô nhiễm của vi sinh vật, các điều kiện vật lý như nhiệt độ, ánh sáng, điều kiện đảo trộn… thì mật độ vi sinh vật trong canh trường xử lý đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất xử lý của phương pháp. Khi ở trong cùng một điều kiện giống nhau, mật độ cao vi sinh vật sẽ là yếu tố thuận lợi để đẩy nhanh hiệu quả và thời gian xử lý.
3.4. Khả năng phân hủy dầu DO và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vậttrên vật liệu mang trên vật liệu mang
3.4.1. Khả năng phân hủy dầu DO và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vậttrên vật liệu mang mút xốp trên vật liệu mang mút xốp
Vật liệu mang mút xốp sau khi được tạo biofilm vi sinh vật đạt mật độ 1,65*1010 CFU/cm3, tiếp tục được đánh giá khả năng phân hủy dầu DO với nồng độ ban đầu là 67.556 mg/l và các hydrocarbon thơm với nồng độ ban đầu là 50 mg/l. Kết quả được trình bày ở Hình 3.4 và Hình 3.5.
79.01
37.12
0.13 0.35 0.61
Hình 3.4. Khả năng phân hủy dầu DO của biofilm vi sinh vật
trên vật liệu mang mút xốp
Hi ệu su ất ph ân hủ y %
Hình 3.5. Khả năng phân hủy phenol và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang mút xốp sau 7 ngày
Kết quả Hình 3.4 và 3.5 cho thấy, biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang mút xốp có khả năng phân hủy tốt dầu DO với hiệu suất phân hủy đạt 90,85% sau 7 ngày. Các thành phần phenol và hydrocarbon thơm được phân hủy lần lượt là 87,36% phenol, 55,59% napthalene, 68,35% anthracene, 95,77% pyren và 72,51% flourene.
3.4.2. Khả năng phân hủy dầu DO và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vậttrên vật liệu mang cellulose trên vật liệu mang cellulose
So với vật liệu mút xốp, cellulose cho khả năng hình thành biofilm thấp hơn với mật độ vi sinh đạt 109 CFU/cm3 sau 36h. Kết quả thử nghiệm khả năng phân hủy dầu DO và các thành phân hydrocarbon thơm cho thấy, biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang cellulose cũng cho khả năng xử lý tốt các thành phần dầu DO cũng như các loại hydrocarbon thơm thử nghiệm. Sau 5 ngày xử lý biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang cellulose có khả năng phân hủy 79,54% hàm lượng dầu DO, và hiệu quả đạt 93,41% sau 7 ngày (Hình 3.6).
Các hàm lượng hydrocarbon thơm cũng cho thấy sự suy giảm hàm lượng đáng kể trong quá trình xử lý. Hiệu suất phân hủy đạt 89,12% phenol, 57,11% napthalene, 70,32% anthracene, 97,33% pyren và 76,61% flourene sau 7 ngày xử lý (Hình 3.7). Nhìn chung, biofilm vi sinh vật trên vật liệu nang mút xốp và cellulose cho khả năng phân hủy dầu DO và các hydrocarbon thơm thử nghiệm tương đương nhau. Hi ệu su ất ph ân hủ y %
Hình 3.6. Khả năng phân hủy dầu DO của biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang cellulose
Hình 3.7. Khả năng phân hủy phenol và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vật
trên vật liệu mang cellulose sau 7 ngày
3.4.3. Khả năng phân hủy dầu DO và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vậttrên vật liệu mang xơ dừa trên vật liệu mang xơ dừa
Trên vật liệu mang xơ dừa, biofilm vi sinh vật cho khả năng hình thành tốt nhất với mật độ vi sinh đạt 1012 CFU/cm3. Sau 7 ngày xử lý, biofilm trên vật liệu mang xơ dừa cho hiệu suất phân hủy dầu DO đạt 99,98% (Hình 3.8.). Biofilm trên vật liệu mang xơ dừa cho khả năng phân hủy tốt các thành phần phenol, pyrene và flourene với hiệu suất đạt 98,23% đối với phenol và 100% đối với pyrene và flourene sau 7 ngày xử lý (Hình 3.9).
Hi ệu su ất ph ân hủ y % Hi ệu su ất ph ân hủ y %
85.61
40.03
0.23 0.29 0.45
Hình 3.8. Khả năng phân hủy dầu DO của biofilm vi sinh vật
trên vật liệu mang xơ dừa
Hình 3.9. Khả năng phân hủy phenol và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vật
trên vật liệu mang xơ dừa sau 7 ngày
3.4.4. Khả năng phân hủy dầu DO và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vậttrên vật liệu mang sỏi nhẹ trên vật liệu mang sỏi nhẹ
Trên vật liệu mang sỏi nhẹ, biofilm được hình thành với mật độ đạt rất cao lên tới 1012 CFU/cm3. Sau 7 ngày xử lý, hiệu suất phân hủy của biofilm trên vật liệu đối với dầu DO là 99,95% (Hình 3.10). Các thành phần phenol và hydrocarbon thơm cũng được phân hủy tốt với hiệu suất đạt 92,32% đối với phenol và trên 59% đối với các thành phần napthalene, anthracene, pyrene và flourene.
Hi ệu su ất ph ân hủ y % Hi ệu su ất ph ân hủ y %
Hình 3.10. Khả năng phân hủy dầu DO của biofilm vi sinh vật trên vật liệu mang sỏi nhẹ
80 70 60 50 40 30 20 10 0
Phenol Napthalene anthracene pyrene flourene
Hình 3.11. Khả năng phân hủy phenol và hydrocarbon thơm của biofilm vi sinh vật
trên vật liệu mang sỏi nhẹ sau 7 ngày
Kết quả thử nghiệm cho thấy, biofilm hình thành tốt trên các loại vật liệu mang sử dụng, không những vậy biofilm trên vật liệu mang còn cho khả năng phân hủy tốt dầu DO và một số loại hydrocarbon thơm thử nghiệm. Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon của biofilm vi sinh vật trong điều kiện của nước thải nhiễm dầu được thu thập từ kho xăng dầu Đỗ Xá, huyện Thường Tín, thành phố Hà Nội.
3.5. Khả năng phân hủy các thành phần hydrocarbon trong nước thải nhiễmdầu của biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật trên vật liệu mang dầu của biofilm hỗn hợp chủng vi sinh vật trên vật liệu mang
3.5.1. Chất lượng nước thải nhiễm dầu
Mẫu nước thải từ bể chứa nước thải tại kho xăng dầu Đỗ Xá, huyện Thường
Hi ệu su ất ph ân hủ y % Hi ệu su ất ph ân hủ y % 0. 72.33 73.71 0. 0. 59.62 0. 58 42 38 29 47
Tín, thành phố Hà Nội, được chúng tôi thu thập và lấy ở các vị trí khác nhau, có váng dầu và có mùi hắc.
Mẫu nước thải sau khi được thu thập được phân tích các chỉ tiêu của nước thải đầu vào theo Quy chuẩn 40:2011/BTNMT ở Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam, kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả phân tích các chỉ tiêu thử nghiệm nước thải ở kho xăng dầu Đỗ
Xá- Thường Tín- Hà Nội
TT Chỉ tiêu thử nghiệm
Đơn vị tính
Mẫu ban đầu
QCVN 40:2011/BTNMT (Cột B) 1 pH 8,5+0,03 5,5-9 2 SS (Chất rắn lơ lửng) mg/l 374+3,06 100 3 BOD5 (20oC) mg/l 13.345+4,48 50 4 COD mg/l 26.686+9,02 150 5 N (Tổng nitơ) mg/l 694,1+2,11 40