KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết RNA, tạo cDNA và nhân đoạn gen CYP97D1
Mẫu sắn sau khi thu thập được tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng kit được mô tả ở phần 2.3.1 - Chương 2.
Hình 3.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số KM94: sắn KM94; XVP: sắn Xanh Vĩnh Phú
Kết quả tách chiết RNA tổng số cho thấy mẫu RNA đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao.
Sau khi tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA, quá trình nhân bản đoạn gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R.
Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3. Chương 2.
Trên điện di đồ (hình 3.2) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có kích thước khoảng 0,5kb. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.
3.2. Kết quả tách chiết DNA và nhân đoạn gen CYP97D1
Song song với quá trình nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số, chúng tôi còn tiến hành nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ DNA tổng số. DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp được mô tả trong phần 2.3.1 - Chương 2.
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số 1. Sắn KM94 2. Sắn xanh Vĩnh Phú
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy ở cả 2 mẫu đều xuất hiện 1 băng sáng, rõ chứng tỏ chúng tôi đã tách được DNA tổng số của các giống sắn với độ nguyên vẹn đảm bảo cho nhân bản đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR tiếp theo (Hình 3.3).
Sau khi tách chiết thành công DNA tổng số, quá trình nhân bản đoạn gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R. Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3 Chương 2.
Hình 3.4. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1 M: marker 1kb; sắn KM94; 2: sắn Xanh Vĩnh Phú
Trên điện di đồ (Hình 3.4) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có kích thước khoảng 1 kb. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.
3.3. Xác định và phân tích trình tự đoạn gen CYP79D1 của 2 giống sắn Xanh Vĩnh Phú và KM94
Do sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide...còn dư và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình xác định trình tự nucleotide. Chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 2 mẫu sắn theo Kit GenJET DNA Purification. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra chất lượng và giải trình tự gen.
Xác định trình tự nucleotide
Sau khi giải trình tự, các đoạn gen CYP79D1 được xử lý bằng chương trình BLAST trên NCBI và phần mềm BioEdit. Các trình tự đoạn gen CYP79D1 của giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM-94 được chúng tôi so sánh với trình tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 trên GenBank.
Sau khi xác định trình tự nucleotide và phân tích bằng các phần mềm, kết quả cho thấy đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú được tách chiết từ RNA đều có kích thước là 669 bp, gen CYP79D1 được tách chiết từ DNA có kích thước là 999 bp. Tiếp theo, chúng tôi so sánh trình tự gen
CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự gen
AF140613.
So sánh trình tự đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự có mã số AF140613 trên Genbank
Trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 có kích thước là 1629 bp. Trình tự gen AF140613 phân lập từ cDNA do vậy trình tự gen này chỉ gồm các đoạn
và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng với gen AF140613 là 99%. Cặp mồi mà chúng tôi thiết kế để nhân bản đoạn gen CYP79D1 nằm từ nucleotide 674 tới nucleotide 1342 của trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613. Đây là
vùng bảo thủ trong họ gen này đảm bảo cho quá trình làm câm lặng gen sau này. Khi so sánh về trình tự nucleotide đoạn gen CYP79D1 của 2 giống Sắn
Xanh Vĩnh Phú và sắn KM94 được tách từ DNA với gen có mã số AF140613 chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G thành nucleotide A). Tuy nhiên trong đoạn trình tự chúng tôi có 2 vùng exon và xen kẽ là 1 vùng intron, vùng intron nằm ở vị trí từ 345 đến 675. Do vậy sự tương đồng giữa 2 đoạn gen này với gen có mã số AF140613 chia làm 2 vùng như mô tả hình 3.5.
Hình 3.5. So sánh bằng đồ họa về trình tự đoạn gen CYP79D1
Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số với trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 trên Genbank cho thấy các đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng là 99%, giữa các trình tự có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G thành nucleotide A) và ở vị trí nucleotide thứ 130 (từ nuceotide G thành nuceotide A).
Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ DNA với trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau: ở trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số không có đoạn intron như khi phân lập từ DNA.
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 CAAGAGATACTTCGGCAAGGGAATGCCGGACGGAGGACCAGGGCCTGAAGAAATCGAGCA KM94-RNA ............................................................ ----
---
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
70 80 90 100 110 120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 CATTGATGCCGTTTTCACTGCCTTGAAATACTTGTATGGGTTTTGCATATCAGATTTCTT KM94-RNA .......................................A....................
Xanh Vinh Phu-RNA .......................................A....................
KM94- DNA .......................................A....................
Xanh Vinh Phu-DNA .......................................A....................
130 140 150 160 170 180
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 GCCTTTCTTGTTGGGACTTGATCTGGATGGCCAAGAAAAATTTGTGCTTGATGCAAATAA KM94-RNA .........A................................................
Xanh Vinh Phu-RNA .........A................................................
KM94- DNA ..........................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ..........................................................
190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 GACCATAAGGGATTATCAGAACCCTTTAATTGATGAAAGGATTCAACAATGGAAGAGTGG KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 TGAAAGGAAGGAAATGGAGGACTTGCTTGATGTTTTCATCACTCTCAAGGATTCAGACGG KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 CAACCCATTGCTCACTCCTGACGAGATCAAGAATCAAATAGCTG---
KM94-RNA ............................................---
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................---
KM94- DNA ............................................TAAGATCACTCTCACT Xanh Vinh Phu-DNA ............................................TAAGATCACTCTCACT 370 380 390 400 410 420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 ---
KM94-RNA ---
Xanh Vinh Phu-RNA ---
KM94- DNA TCTTACAATTGCATGCTAATGATTGATTATGATGGTGAAATTTATATGGGACTCACTTTT Xanh Vinh Phu-DNA TCTTACAATTGCATGCTAATGATTGATTATGATGGTGAAATTTATATGGGACTCACTTTT 430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 ---
KM94-RNA ---
Xanh Vinh Phu-RNA ---
KM94- DNA TATTTTTTTATAGTAATTAGTATTTAATTATGATAAAAAAAAATTGGGTGAGGAAACATT Xanh Vinh Phu-DNA TATTTTTTTATAGTAATTAGTATTTAATTATGATAAAAAAAAATTGGGTGAGGAAACATT 490 500 510 520 530 540
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 ---
KM94-RNA ---
Xanh Vinh Phu-RNA ---
KM94- DNA TCTAATTCATATTTTAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAACTTTTTTTGGGTATTTTGA Xanh Vinh Phu-DNA TCTAATTCATATTTTAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAACTTTTTTTGGGTATTTTGA 550 560 570 580 590 600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 ---
KM94-RNA ---
Xanh Vinh Phu-RNA ---
KM94- DNA ATTTCCCCCACAAAATTTTTATTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGAGAAACTTTTTC
610 620 630 640 650 660
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 ---
KM94-RNA ---
Xanh Vinh Phu-RNA ---
KM94- DNA TGTGTATTTTGAATTTCTCGCACAAAATTTATATATATTTAAAAGAAATTAACATAAGTA Xanh Vinh Phu-DNA TGTGTATTTTGAATTTCTCGCACAAAATTTATATATATTTAAAAGAAATTAACATAAGTA 670 680 690 700 710 720
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 ---AAATTATGATAGCAACAGTAGATAACCCATCAAACGCAATCGAATG KM94-RNA ---..............................................
Xanh Vinh Phu-RNA ---..............................................
KM94- DNA TATATGGTTGCAGG..............................................
Xanh Vinh Phu-DNA TATATGGTTGCAGG..............................................
730 740 750 760 770 780
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 GGCAATGGGGGAGATGCTAAATCAACCAGAAATCCTGAAGAAGGCCACAGAAGAGCTCGA KM94-RNA ..........................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ..........................................................
KM94- DNA ..........................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ..........................................................
790 800 810 820 830 840
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 CAGGGTGGTCGGCAAAGACAGGCTTGTTCAAGAATCCGACATCCCCAACCTTGACTATGT KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
850 860 870 880 890 900
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 CAAAGCCTGTGCAAGAGAAGCCTTCAGGCTCCATCCAGTAGCACACTTCAATGTCCCTCA KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 TGTAGCCATGGAAGACACTGTCATTGGTGATTACTTTATTCCAAAGGGCAGCTGGGCAGT KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
970 980 990
....|....|....|....|....|....|....|....
AF140613_CYP79D1 TCTCAGCCGCTATGGGCTCGGCAGGAACCCAAAGACATG KM94-RNA .......................................
Xanh Vinh Phu-RNA .......................................
KM94- DNA .......................................
Xanh Vinh Phu-DNA .......................................
Dựa trên trình tự của gen CYP79D1 và CYP79D2 của họ cytochrome P450, chúng tôi sử dụng thuật toán Blast để xác định toàn bộ vị trí các gen CYP79D1 và
CYP79D2 trên cơ sở dữ liệu của sắn. Khi tìm kiếm gen CYP79 ở sắn trên cơ sở dữ liệu của sắn, chúng tôi nhận thấy gen CYP79D1 nằm trên nhiễm sắc thể 13 có mã định danh là cassava4.1_005059m nằm ở locus Manes.13G094200, CYP79D2 nằm trên nhiễm sắc thể 12 có mã định danh là cassava4.1_005079m nằm ở locus Manes_12G133500. Ngoài ra, chúng tôi còn tìm thấy gen CYP84A1 nằm trên nhiễm sắc thể 4 có mã định danh là cassava4.1_024692m nằm ở locus Manes.04G084200, gen CYP81D1 nằm trên nhiễm sắc thể 5 có mã định danh là cassava4.1_024196m nằm ở locus Manes.05G178600, gen CYP93A2 nằm trên nhiễm sắc thể 7 có mã định danh là cassava4.1_027206m nằm ở locus Manes.07G003300 (hình 3.6)
Hình 3.6. Vị trí phân bố của một số gen CYP trên hệ gen sắn