Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Hai giống sắn nghiên cứu được trồng và tiến hành thu mẫu để làm thí nghiệm. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết RNA tổng số bằng kit như sau:
(1) Nghiền 30mg mô lá trong nitơ lỏng. Chuyển 300µl dung dịch chiết vào ống eppendorf 1,5 ml, bổ sung β-mercaptoethanol. Vortex trong 10 giây.
(2) Bổ sung 600μl proteinase, trộn đều và ủ ở 15-25°C trong 10 phút. (3) Li tâm 12000 vòng/phút trong 5-10 phút. Thu dịch sang ống eppendorf mới.
(4) Bổ sung 450 µl ethanol (96-100%) và trộn đều.
(5) Chuyển 700 μl dung dịch vào cột GeneJET RNA. Li tâm cột 12000 vòng/phút trong 1 phút. Thu cặn.
(6) Chuyển cột GeneJET RNA vào ống eppendorf 2ml mới.
(7) Bổ sung 700 μl dung dịch đệm 1 vào cột GeneJET RNA và li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch và đặt cột tinh lọc trở lại ống thu.
(8) Bổ sung 600 μl dung dịch đệm 2 vào cột GeneJET RNA và li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ dịch và đặt cột tinh lọc trở lại ống thu.
(9) Bổ sung 250 μl dung dịch đệm 2 vào cột GeneJET RNA và li tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút. Chuyển cột GeneJET RNA sang ống eppendorf 1,5ml mới vô trùng.
(10) Bổ sung 100 μl nước vào giữa màng lọc. Li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột, sử dụng trực tiếp RNA thu được hoặc lưu trữ RNA ở -20°C cho đến khi sử dụng.
2.3.2. Phương pháp tạo cDNA
Từ RNA tổng số của hai mẫu sắn, cDNA được tổng hợp theo các bước (1) Bổ sung hóa chất vào ống eppendorf đã được khử trùng với tỉ lệ như sau: Template RNA: 0,1 μg - 5 μg
Primer Oligo (dT)18: 1 μl Nước: 12 μl
(2) Ủ ở nhiệt độ 65oC trong 5 phút sau đó chuyển sang đá lạnh.
(3) Bổ sung tiếp các thành phần: 5X reaction Buffer: 4 μl
RiboLock Rnase Inhibitor: 1 μl 10 mM dNTP Mix: 2 μl
Revertaid M-MuLV RT: 1μl Đảo đều và li tâm nhanh.
(4) Bổ sung mồi hexamer, đặt vào máy PCR theo chu trình nhiệt 25°C trong 5 phút, 42°C trong 60 phút và 70oC trong 5 phút.
Sản phẩm được lưu giữ ở -20oC.
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Để tách chiết được DNA tổng số, chúng tôi sử dụng lá của hai giống sắn nghiên cứu. Tách chiết DNA tổng số bằng dung dịch đệm chứa CTAB là phương pháp được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền thực vật. Dựa trên quy trình chuẩn của Saghai và Maroof (1994), nhiều quy trình tách chiết được xây dựng cho từng đối tượng thực vật. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết DNA tổng số như sau:
(1) Các lá được lựa chọn sẽ được rửa sạch bụi, xịt qua cồn ethanol 70% sau đó để khô trong không khí và cho mẫu lá mỗi giống vào riêng túi sạch, buộc kín, ghi tên giống, giữ mẫu trong tủ âm 85oC ít nhất 2h.
(2) Nghiền 0.8 g mô lá sắn trong cối chày sứ thành dạng bột mịn. Bổ sung 6ml đệm rửa (Tris-HCl 100mM pH8; EDTA 5mM pH8; NaH2PO4 0.4%; sorbitol
350mM; H2O), nghiền tiếp đến khi trở thành dung dịch đồng nhất. Chia hỗn hợp vào các ống eppendorf 2ml, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC.
(3) Loại dịch thu tủa, bổ sung đệm rửa, tiếp tục ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Quá trình được lặp lại từ 2 – 3 lần, loại dịch thu tủa.
(4) Bổ sung hóa chất CTAB 4% vào mỗi ống eppendorf . Ủ trong bể ổn nhiệt 65°C, trong vòng 60’ (5-10’ đảo một lần).
(5) Bổ sung chlorofom tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ 20’.
(6) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15’ ở 4°C. Thu pha trên sang ống eppendorf 1.5 ml mới, tủa DNA bằng cồn isopropanol tỷ lệ 1:1 trong tủ âm 20°C ít nhất 2h. Ly tâm 12000 vòng/phút, 15’, 4°C, đổ dịch.
(7) Rửa tủa bằng cồn 70°: bổ sung 500µl cồn 70o, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15’ ở 4°C, loại dịch thu tủa. Lặp lại 2 – 3 lần.
(8) Làm khô tủa ở trong box cấy và hòa tan trong 50µl nước khử ion, bảo quản mẫu DNA ở -20oC.
(9) Điện di gel agarose 1% kiểm tra.
2.3.4. Phương pháp PCR
Đoạn gen CYP79D1 được khuyếch đại bằng cặp mồi ME. Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 và trình tự như sau:
ME-F: 5’-CAAGAGATACTTCGGCAAGG-3’ ME-R: 5’-ACCATGTCTTTGGGTTCCTG-3’ Nồng độ các thành phần và chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Nồng độ Hàm lượng
1 Nước khử ion 6 µl
2 GoTaq Green Master Mix 2X 7,5 µl
3 ME – F 10pmol/µl 0,5µl
5 cDNA khuôn 10 - 20 ng/µl 0,5µl
Tổng thể tích 15µl
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 4 phút 1
2 Biến tính 94 40 giây
35
3 Gắn mồi 59 40 giây
4 Kéo dài chuỗi 72 40 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
6 Kết thúc 4 ∞
Sản phẩm được lưu trữ ở 4 oC.
2.3.5. Phương pháp điện di sản phẩm PCR
Điện di sản phẩm PCR khoảng 30 phút trên gel agarose 1% ở 110V trong dung dịch đệm TAE 1X. Gel sau khi điện di được nhuộm với ethidium bromide nồng độ 0,5mg/ml trong 5 phút, rửa sạch, sau đó soi dưới đèn UV có bước sóng 320 nm và chụp ảnh.
2.3.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification gồm các bước sau:
(1) Bổ sung Binding buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1 : 1 về thể tích. (2) Chuyển sang cột lọc, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.
(3) Bổ sung 700 µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. (4) Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn. (5) Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch đáy.
(6) Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm trong tủ -20oC.
2.3.7. Phương pháp đọc trình tự
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, trình tự đoạn gen CYP79D1 được xác
định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABIPRISM@3100 Genetic Analyzer (Applied Biosytem) tại Viện Công nghệ Sinh học.