STT Thành phần Nồng độ Thể tích (l) 1 PCR Masster Mix 2X 7,5 2 GDP-D-F 10 pmol/l 0,5 3 GDP-D-R 10 pmol/l 0,5 4 DNA 200 ng/l 0,5 5 Nước khử ion - 6,0 Tổng thể tích 15,0
Chu trình nhiệt được đặt như sau: 95oC trong 2 phút; lặp lại 35 chu kỳ với nhiệt độ là: 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 40 giây; sau đó để ở 72oC trong 5 phút và lưu giữ ở 8oC.
Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong Ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
Tách plasmid
phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2.6. Phương pháp xác định trình tự gen GDP-D
Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu gen GDP-D được xử lý bằng các phần mềm Tin sinh học. Phần mềm BLAST trên NCBI sử dụng trong so sánh mức độ tương đồng nhằm khẳng định gen GDP-D đã phân lập. Phần mềm BioEdit sử dụng trong so sánh trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn. Phần mềm DNAstar sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền dựa trên trình tự nucleotide của gen GDP-D.
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm -Đại học Thái Nguyên.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nhân bản và giải trình tự gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS
3.1.1. Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR
Cặp mồi GDP-D-F/GDP-D-R được thiết kế dựa trên trình tự đoạn mã hóa của gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.
Giống quýt BS-LS có chất lượng quả tốt, sinh trưởng khỏe được sử dụng làm đối tượng phân lập gen GDP-D. Tiến hành thu mẫu mô vùng sinh trưởng của ngọn cây để phục vụ thí nghiệm tách chiết DNA. DNA tổng số được tách chiết, gen GDP-D được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi GDP-D-
F/GDP-D-R và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của mẫu quýt BS-LS với cặp mồi GDP-D-F và GDP-D-R; 1: mẫu BS-LS; M: thang chuẩn
DNA 1kb
Kết quả thu được ở hình 3.1 cho thấy, mẫu quýt BS-LS cho sản phẩm PCR là một băng DNA với kích thước ước tính khoảng 1 kb, phù hợp theo tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá
GDP-D ở cây cam ngọt mang mã số HQ224946 trên GenBank. Tuy nhiên, để
~1kb 0,75kb →
khẳng định chính xác sản phẩm thu được là gen GDP-D chúng tôi tiến hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide và so sánh với trình tự GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas và nhân dòng bằng PCR để thu lượng sản phẩm đủ lớn phục vụ giải trình tự nucleotide.
3.1.2. Kết quả tách dòng gen GDP-D
Sản phẩm PCR kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và được tiến hành tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT rồi biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α bằng sốc nhiệt (42oC trong 1 phút 30 giây). Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc màu trắng với cặp mồi đặc hiệu.
Chọn ngẫu nhiên ở đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen GDP-D phân lập từ mẫu BS-LS 4 khuẩn lạc màu trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR. Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong Ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. Kết quả cho thấy, tất cả 4 dòng khuẩn lạc được kiểm tra đều dương tính với phản ứng PCR.
Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR đã được chọn để tách plasmid tái tổ hợp và đem đi giải trình tự. Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong Ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc
(1, 2, 3, 4: GDP-D khuếch đại từ khuẩn lạc BS-LS; M: thang DNA chuẩn 1 kb) ~1kb
3.1.3. Đặc điểm của trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS
Kết quả xác định trình tự gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động được trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3: Đặc điểm trình tự nucleotide của mẫu BS-LS thu được bằng máy
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D trên GenBank mang mã số
HQ224946
Kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit cho thấy, trình tự gen GDP-D
phân lập từ giống quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G. Tỷ lệ A+T= 53,19%; G+C= 46,81%.
So sánh trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự
gen GDP-D mã số HQ224946 trên GenBank sử dụng thiết kế mồi trên hình 3.4
cho thấy có 1083 vị trí nucleotide giống nhau, chỉ sai khác ở 3 vị trí nucleotide, đó là các vị trí 370, 371, 984 (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự nucleotide của gen
GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946
TT Vị trí nucleotide
Gen GDP-D phân lập từ giống BS-LS
Gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank
1 370 - T
2 371 - T
Ngoài ra, bằng BLAST trong NCBI cho thấy trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng so với trình tự gen GDP-D mang mã số HQ224946 sử dụng để thiết kế cặp mồi PCR là 99%. Bên cạnh đó, trình tự
gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS còn có tỷ lệ tương đồng với một số
trình tự khác mang mã số XM 025101133, XM 006486355, XM 006435547 là 95%; FJ643600 là 87%; XM021440285, XM021440284 là 85% (Hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide của gen
GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tự gen đã công bố
trên GenBank
Như vậy, chúng tôi đã tách dòng thành công và giải trình tự gen
GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn với chiều dài 1083bp trong đó 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G.
Tiếp tục so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và với protein suy diễn từ trình tự gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank bằng phần mềm BioEdit được thể hiện ở hình 3.6. Kết quả cho thấy, protein do gen GDP-D mã hóa đều có 361 amino acid. So với protein suy diễn từ trình tự gen mang mã số HQ224946 trên GenBank thì trình tự amino acid của mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng là
99%. Tuy nhiên, các trình tự amnio acid của protein GDP-D cũng có sự khác nhau ở 2 amino acid (Bảng 3.2).
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.
Bảng 3.2. Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tự protein suy diễn
của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946
TT Vị trí amino acid
Protein suy diễn từ gen GDP-D phân lập
từ giống BS-LS
Protein suy diễn từ gen
GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank
1 124 X F
Từ hình 3.6 và bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn của gen
GDP-D giữa giống quýt BS-LS và trình tự protein suy diễn của gen GDP-D đã
công bố trên GenBank mang mã số HQ224946 có 358 vị trí amino acid giống nhau, chỉ khác ở 2 vị trí acid amin, đó là các vị trí 124, 328.
3.2. Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D
Tiến hành so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS với 7 trình tự gen GDP-D đã công bố trên GenBank để xác định hệ số tương đồng và hệ số sai khác của các trình tự gen GDP-D, đồng thời thiết lập sơ đồ hình cây để phân tích sự đa dạng của các mẫu quýt thông qua trình tự gen GDP-D.